Проникновение лейкоцитов мышц кремастеров в мышах, оцениваемых внутривиталовой микроскопией
Summary
Здесь мы покажем, как выполнять интравитальной микроскопии на пост-капиллярных венулей мыши кремастер мышцы. Обычно применяется к различным моделям воспаления и сепсиса, особенно те, вызванные хемокины и цитокины, мы подчеркиваем его актуальность в изучении мусколопатии с участием преувеличенных мышечных инфильтрации лейкоцитов.
Abstract
Интравитальной микроскопии (IVM) широко используется для мониторинга физиологических и патофизиологических процессов в каскаде набора лейкоцитов in vivo. Текущий протокол представляет собой практический и воспроизводимый метод визуализации лейкоцитов эндотелия взаимодействия, ведущие к лейкоцитов вербовки в скелетных мышц производных тканей в нетронутом организме мыши. Модель применима ко всем областям исследований, которые сосредоточены на активации гранулоцитов и их роли в болезни.
Мы предоставляем пошагу протокол, чтобы провести метод и выделить потенциальные подводные камни и технические трудности. Протокол охватывает следующие аспекты: экспериментальные настройки и необходимый материал, анестезия мыши, вскрытие мышц кремастеров, а также трахеальная и сонная канистру, записи IVM и автономный анализ. Форматы данных, такие как лейкоциты адептов, подвижного потока (RF) и фракция подвижного потока (RFF), подробно разъясняются и обсуждаются соответствующие приложения. Представитель результаты от дистрофин дефицитных мышей mdx приведены в разделе результатов.
IVM является мощным инструментом для оценки набора лейкоцитов в условиях in vivo; однако, разграничение, например, эндотелиальной и лейкоцитной функции может потребовать сяковики с ex vivo установки, как поток камеры экспериментов. Кроме того, генетическое происхождение интересующих животных может значительно повлиять на базовый набор, требуя индивидуальной тонкой настройки предусмотренного протокола. Несмотря на свои ограничения, IVM может служить платформой для легкого перевода в пробирке выводы в живой позвоночный организм.
Introduction
Интравитальной микроскопии (IVM) является широко применяется инструмент в области биологии лейкоцитов. Leukocyte вербовки следует каскад четко определенных событий, инициированных лейкоцитов захвата, прокатки и прилипания к эндотелиальной стенки, и, наконец, трансмиграции и экстравазации лейкоцитов на фактическое место воспаления1. Каждый шаг опосредовано и контролируется различными хемокинами (например, IL-8/CXCL8), рецепторами (например, LFA-1, Mac-1) и соответствующими молекулами эндотелиальных клеток (например, ICAM-1, VCAM-1 и E-Selectin)2,3. Взаимодействие различных регуляторных сайтов, контролирующих факторов и посредников каскада набора лейкоцитов, таких как рецептор передовых гликовых конечных продуктов (RAGE), межклеточная молекула адгезии 1 (ICAM-1), C-X-C мотив лиганд (CXCL)1/2 и их рецептор CXCR2 были обнаружены с помощью IVM4,,6,77,89.
Метод IVM был описан для многих различных органов и тканей, таких как кишечник10, кожа11,лимфатические узлы12, эмбриональный желток мешок13 и другие. Однако наиболее широко изученным методом IVM является модель кремастерства, впервые описанная у крыс14. Хотя до сих пор используется в крысах15, метод в настоящее время в основном применяется у мышей из-за высокого изобилия различных трансгенных линий. Наша группа недавно подчеркнул потенциальную роль крематер IVM в области воспалительных muscolopathies как мышечная дистрофия Дюшенна (DMD) изучения дистрофии дефицита mdx мышей16. Из-за своей тонкой переплетенной и легко доступной волоконной композиции, мышца кремастеров представляет собой идеальную мышцу кандидата, которая будет изучена в целом с помощью легкой или флуоресцентной микроскопии. Leukocyte вербовки и экстравазации в основном происходят в пост-капиллярных венцев, которые могут быть легко определены на непрерывном мышечном слое в мышце кремастера.
Преимуществом in vivo изображений по сравнению с другими анализами in vitro является ее биологический контекст в живом организме. В то же время, разграничение клеток конкретных взносов на измененный набор лейкоцитов может потребовать дополнительных моделей в пробирке, как поток камер или эндотелиальных анализов. Сочетание нескольких методов даст наиболее убедительные данные. Ученые должны знать об ограничениях модели кремастеров, так как любые хирургические манипуляции приведут к увеличению торговли лейкоцитами и вербовке. Таким образом, базовый набор трудно оценить с помощью этого метода. Несмотря на широкое применение, IVM кремастер может быть сложной задачей и новая установка может занять время и ресурсы, чтобы установить. Теперь мы предоставляем простой протокол, который поможет избежать некоторых распространенных ошибок в IVM. Кроме того, ограничения будут обсуждаться и бесплатные методы будут выделены, где это применимо.
IVM кремастера представляет собой идеальный подход, который должен быть реализован в области воспалительных и инфекционных исследований. В частности, модель кремастеров может представлять большой интерес для ученых, изучающих биологию скелетных мышц в контексте воспалительных заболеваний.
Protocol
Representative Results
Discussion
IVM как метод был широко использован для изучения различных типов клеток в различных органах и был широко описан и обсужден19. Основная цель этого исследования заключается в обеспечении эффективного подхода к настройке и выполнению IVM в мышцах кремастера. Практика метода да?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Федеральным министерством образования и исследований Германии (BMBF) 01GL1746E в рамках консорциума PRIMAL. Авторы признают Бритту Хекманн и Сильвию Пезер за умелую техническую помощь.
Materials
| Material | |||
| Ketanest S | Pfizer Pharma GmbH | PZN: 08509909 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: ketamine |
| Xylazine | CP-Pharma GmbH | Article-nr.: 1205 | anesthesia. Generic / IUPAC Name: xylazine (as hidrochloride) |
| Saline Solution | B. Braun Melsungen | PZN 02737756 | surgical preparation. Generic / IUPAC Name: sodium chloride |
| Syringe needle Omnican F | B. Braun Melsungen | REF 9161502 | surgical preparation |
| Suture 6/0 USP | Resorba | REF 4217 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #10 | BD GmbH | Supplier No. 427401 | surgical preparation |
| Polyethylene tube #90 | BD GmbH | Supplier No. 427421 | surgical preparation |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | CAS Number 989-38-8 | leukocyte staining. Generic / IUPAC Name: ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate |
| Setup Equipment | |||
| Upright microscope | Olympus | BX51W1 | microscopy |
| 40-fold objective | Zeiss | Achroplan 40 × /0.80 W | microscopy |
| ImSpector software | Lavision Biotec GmbH | ver. 4.0.469 | software |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | ver. 1.51j8 | software |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zanardo, R. C. O., et al. A down-regulatable E-selectin ligand is functionally important for PSGL-1-independent leukocyte-endothelial cell interactions. Blood. 104 (12), 3766-3773 (2004).
- Woodfin, A., et al. ICAM-1-expressing neutrophils exhibit enhanced effector functions in murine models of endotoxemia. Blood. 127 (7), 898-907 (2016).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 cooperate in mediating leukocyte recruitment during acute inflammation in vivo. Blood. 116 (5), 841-849 (2010).
- Braach, N., et al. RAGE controls activation and anti-inflammatory signalling of protein C. PloS One. 9 (2), 89422 (2014).
- Frommhold, D., et al. RAGE and ICAM-1 differentially control leukocyte recruitment during acute inflammation in a stimulus-dependent manner. BMC Immunology. 12 (1), 56 (2011).
- Braach, N., et al. Anti-inflammatory functions of protein C require RAGE and ICAM-1 in a stimulus-dependent manner. Mediators of Inflammation. 2014, 743678 (2014).
- Girbl, T., et al. Distinct Compartmentalization of the Chemokines CXCL1 and CXCL2 and the Atypical Receptor ACKR1 Determine Discrete Stages of Neutrophil Diapedesis. Immunity. 49 (6), 1062-1076 (2018).
- Smith, M. L., Olson, T. S., Ley, K. CXCR2- and E-selectin-induced neutrophil arrest during inflammation in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 200 (7), 935-939 (2004).
- Emre, Y., Jemelin, S., Imhof, B. A. Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time. Journal of Visualized Experiments. (105), (2015).
- Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear. Microvascular Research. 19 (3), 374-379 (1980).
- von Andrian, U. H. Intravital microscopy of the peripheral lymph node microcirculation in mice. Microcirculation. 3 (3), 287-300 (1996).
- Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
- Grant, R. T. Direct observation ok skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). The Journal of Physiology. 172 (1), 123-137 (1964).
- Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time digital imaging of leukocyte-endothelial interaction in ischemia-reperfusion injury (IRI) of the rat cremaster muscle. Journal of Visualized Experiments. (66), e3973 (2012).
- Kranig, S. A., et al. Dystrophin deficiency promotes leukocyte recruitment in mdx mice. Pediatric Research. 11, 4457 (2019).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. Journal of Visualized Experiments. (52), e2874 (2011).
- Reichenbach, Z. W., Li, H., Gaughan, J. P., Elliott, M., Tuma, R. IV and IP administration of rhodamine in visualization of WBC-BBB interactions in cerebral vessels. Microscopy Research and Technique. 78 (10), 894-899 (2015).
- Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
- Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).
