Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento de hepatócitos de camundongos de fígados de camundongos adultos usando uma técnica de perfusão de colagem modificada. Também é descrita a cultura de longo prazo dos hepatócitos em um ambiente de sanduíche de colágeno 3D, bem como imunorotulagem dos componentes citoesqueléticos para estudar a formação canalicular biliar e sua resposta ao tratamento.
Hepatócitos são as células centrais do fígado responsável por sua função metabólica. Como tal, eles formam um epitélio exclusivamente polarizado, no qual dois ou mais hepatócitos contribuem com membranas apical para formar uma rede canalicular biliar através da qual a bile é secretada. A polarização hepatocito é essencial para a formação canalicular correta e depende das interações entre o citoesqueleto de hepatocito, contatos celulares e a matriz extracelular. Estudos in vitro sobre o envolvimento do citoesqueleto de hepatocito na formação de canaliculi e sua resposta a situações patológicas são prejudicados pela falta de cultura celular, que se assemelharia à estrutura da rede canaliculi in vivo. Descrito aqui é um protocolo para o isolamento de hepatócitos de camundongos do fígado de rato adulto usando uma técnica de perfusão de colagem modificada. Também descrita é a produção de cultura em um ambiente de sanduíche de colágeno 3D, que é usado para imunorotulagem de componentes citoesqueléticos para estudar a formação canalicular biliar e sua resposta aos tratamentos in vitro. Mostra-se que as culturas hepatocitos de sanduíche de colágeno 3D respondem a tratamentos com toxinas (etanol) ou citoesqueleto de actina alterando drogas (por exemplo, blebbistatin) e servem como uma ferramenta valiosa para estudos in vitro de formação e função de canaliculi biliares.
Hepatócitos, as estruturas celulares centrais do fígado que são responsáveis por suas funções metabólicas, são células epiteliais exclusivamente polarizadas. Sua polarização, aparecendo em mamíferos logo após o nascimento, resulta na formação da rede canalicular biliar e é essencial para a secreção biliar de bile. Membranas apical de hepatócitos formam coletivamente canaliciuli biliares, enquanto membranas basais permanecem em contato com o endotelio dos sinusoides. A perda da polarização hepatocito leva à redistribuição de transportadores biliares e resulta em processos patológicos conectados à retenção biliar no fígado (ou seja, cholestasis).
O estabelecimento e a manutenção da polarização hepatocto e o desenvolvimento de canaliculi biliares implicam mecanismos complexos. Os processos subjacentes dependem da interação coletiva entre o citoesqueleto hepatocito, contatos celulares e interações com a matriz extracelular1. O citoesqueleto hepatocito consiste em todas as três redes de filamento, o citoesqueleto actina, microtúbulos e filamentos intermediários, que fornecem suporte estrutural para a formação canalicular. O papel diferencial dos componentes citoesqueléticos na regeneração e manutenção de redes canaliculares biliares foi previamente ilustrado in vitro em culturas hepatocitos de colágeno-sanduíche 3D2.
Microfilamentos actinas e microtúbulos são importantes durante os estágios iniciais de polarização da membrana hepatócito nos locais da geração canaliculus2. O citoesqueleto de actina estabelece a estrutura e função dos canaliculi biliares, formando microfilamentos associados à membrana e o anel circumferential, apoiando assim a arquitetura canalicular e inserindo o citoesqueleto de actina em junções apertadas e aderem3. O anel de filamentos intermediários de queratina fora do citoesqueleto actina estabiliza ainda mais a estrutura canalicular3.
A importância das proteínas nos complexos juncionais de hepatócitos na organização da arquitetura de canaliculi biliar tem sido bem documentada em vários modelos de camundongos knock-out, que mostram canaliculi distorcidos em camundongos sem proteínas juncionais apertadas e/ou aderentes4,5,6. A exclusão da proteína de junção aderentes α-catenin tem sido mostrado para levar à desorganização do citoesqueleto hepatocito actina, dilatação de lúmens canaliculares biliares, junções apertadas gotejante, e efetivamente a um fenótipo cholestática4. Além disso, estudos in vitro têm mostrado a importância dos componentes de junção aderentes E-cadherin e β-catenina na remodelação do lúmen afalco hepatocelular e tráfico deproteínas 7.
Surpreendentemente, a ablação do citoesqueleto crosslinking proteína plectina, que é o principal organizador de queratina, revelou fenótipos comparáveis aos ligados à actina citoesqueleto8. Isso sugere um papel crítico dos filamentos intermediários de queratina no suporte da estrutura canalicular. Estudos in vitro utilizando sanduíches de colágeno hepatócito 3D também mostraram a importância da proteína kinase ativada por AMP e seu ativador upstream LKB1 na formação de rede canalicular biliar9. Estes resultados foram confirmados então mais por estudos in vivo subseqüentes10,11. Assim, tornou-se claro que estudos in vitro são necessários para promover a compreensão dos processos de sinalização envolvidos no estabelecimento da polarização hepatocito, formação adequada da rede canalicular e secreção biliar.
Um grande desafio no estudo de processos conectados com a formação canalicular biliar e sua resposta a situações patológicas in vitro é o uso de condições de cultura celular que se assemelham à situação in vivo12. Os hepatócitos primários recém-isolados não são polarizados; assim, perdem sua função, morfologia e canaliculi bile funcional em condições de cultura 2D (por exemplo, mudanças na regulação gênica, polarização e desdiferenciação13,14,15). Apesar deste fato, hepatócitos recém-isolados refletem mais de perto a natureza do fígado in vivo, ao contrário das linhas celulares derivadas do fígado16. Mesmo que tenham sido usados no passado, as linhas celulares imortalizadas não exercem a morfologia característica epiteliana dos hepatócitos, e os lúmens canaliculares biliares formados por essas células se assemelham a canaliculi hepáticos mal7. Recentemente, culturas 3D de hepatócitos primários, de camundongos e ratos, tornaram-se uma ferramenta útil para investigar processos envolvidos na formação de rede canalicular biliar in vitro9. Hepatócitos primários cultivados entre duas camadas de colágeno (referido como uma cultura de sanduíche de colágeno 3D) podem repolarizar em vários dias. Por causa das altas demandas técnicas necessárias ao cultivar hepatócitos de camundongos em sanduíches de colágeno 3D, aqui apresentamos um protocolo complexo para isolar, cultivar e imunorótulo hepatócitos de camundongos embutidos em sanduíches de colágeno 3D, a fim de caracterizar o envolvimento de componentes citosqueléticos durante a formação canalicular biliar.
O uso de culturas hepatocitos primárias de camundongos é importante para que estudos in vitro compreendam melhor os processos de sinalização envolvidos no estabelecimento da polarização hepatocito, formação adequada da estrutura canalicular e secreção biliar. Os desafios em isolamento e cultura de longo prazo de hepatócitos primários de camundongos na cultura 2D impulsionaram a invenção de várias abordagens técnicas com maior efetuez a vida do isolamento e longevidade de células isoladas, cada uma com várias vantagens e Desvantagens. Agora é amplamente aceito que as culturas 2D de hepatócitos primários imitam apenas um número limitado de atributos da biologia hepática por um curto período de tempo. Assim, o cultivo 3D em um arranjo sanduíche de colágeno está substituindo amplamente as condições 2D, particularmente quando focada na função do citoesqueleto na biologia hepática (por exemplo, efeitos tóxicos de drogas ou organização espacial do transporte biliar).
Desde a década de 1980, vários protocolos para o isolamento de hepatócitos de camundongos com várias modificações foram descritos. A abordagem de perfusão de colagem em duas etapas tornou-se amplamente utilizada em muitos laboratórios. A adição de centrifugação gradiente no protocolo de isolamento permite a remoção de células mortas19,20 e aumenta significativamente o número de células viáveis (aqui, rotineiramente para ~93%). Mesmo que esta etapa estenda o tempo de manuseio das células e resulte em números celulares reduzidos21,esta etapa é vista como necessária na cultura sanduíche de colágeno 3D para a formação adequada da rede bile canalicular. Além disso, é mais importante proceder de forma rápida e precisa durante as etapas de perfusão, o que encurta o tempo em que as células são manuseadas.
Outros fatores importantes que aumentam a viabilidade das células e sua capacidade de formar redes canaliculares em 3D é o uso de soluções preparadas na hora e evitar bolhas durante a perfusão. Portanto, as soluções devem ser preparadas no dia do isolamento de hepatócitos de camundongos, e a bomba peristáltica e tubulação devem ser verificadas ao mudar de soluções. Se o protocolo for seguido de perto, o isolamento dos hepatócitos primários deve ser bem sucedido com um alto rendimento de células viáveis.
Outro fator crítico na cultura hepatocito 3D de longo prazo é a fonte inicial de hepatócitos primários que são usados. É importante usar animais de 8 a 12 semanas de idade, que servem como doadores ideais de hepatócitos. O uso de hepatócitos de animais mais velhos não foi tão bem sucedido na cultura de longo prazo, já que esses hepatócitos mudaram sua morfologia com mais freqüência, despolarizaram e deixaram de formar redes canaliculares. Além disso, chapeamento hepatócitos em gel de colágeno devidamente neutralizado formado a partir de solução relativamente altamente concentrada é um passo vital. Na maioria dos protocolos, concentrações de cerca de 1 mg/mL são usadas. Depois de muitas otimizações, uma concentração de 1,5 mg/mL é ideal para o cultivo de hepatócitos de longo prazo e fornece hepatócitos altamente organizados com canalículos biliares formados.
Este protocolo fácil de seguir permite o cultivo a longo prazo de hepatócitos de camundongos primários. Os resultados representativos demonstram um amplo espectro de uso para hepatócitos de camundongos primários cultivados em 3D ao estudar o papel dos componentes citoesqueléticos na formação de canaliculi biliares.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Agência de Subvenções da República Checa (18-02699S); Agência de Subvenção do Ministério da Saúde da República Checa (17-31538A); o Projeto de Pesquisa Institucional da Academia Checa de Ciências (RVO 68378050) e os projetos MEYS CR (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395, e OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775); Universidade Charles (bolsa pessoal para K.K.), e um programa operacional Praga-Competitividade projeto (CZ.2.16/3.1.00/21547). Reconhecemos o Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, República Checa (projetos MEYS CR apoiados LM2015062 e LO1419) para apoio com a imagem de microscopia apresentada.
35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
EGTA | ROTH | 3054.2 | |
FBS | Gibco | 10270-106 | |
Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
Glycine | Pufferan | G 05104 | |
Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Water bath | Nuve | NB 9 | |
Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
Zoletil | Vibrac | VET00083 |