Nous décrivons un protocole pour l’implantation guidée d’ultrason des lignes canalaires canalaires canalaires d’adénocarcinome murine-dérivées de l’adénocarcinome de voie inole directement dans le site indigène de tumeur. Cette approche a eu comme conséquence les tumeurs pancréatiques détectables par balayage d’ultrason dans un délai de 2-4 semaines de l’injection, et a réduit de manière significative l’ensemencement de cellules de tumeur proportion sur la paroi péritonéale par rapport à l’implantation orthotopic chirurgicale.
Le succès récent du blocus de point de contrôle immunitaire dans le mélanome et l’adénocarcinome de poumon a galvanisé le domaine de l’immuno-oncologie aussi bien que a indiqué les limites des traitements courants, car la majorité des patients ne répondent pas à l’immunothérapie. L’élaboration de modèles précliniques précis pour identifier rapidement des combinaisons thérapeutiques nouvelles et efficaces est essentielle pour répondre à ce besoin clinique non satisfait. L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDA) est un exemple canonique d’une tumeur résistante au blocus de point de contrôle immunitaire avec seulement 2% de patients répondant à l’immunothérapie. Le KrasG12DMD/-génétiquement modifié ; Trp53R172HMD/-; Pdx-1 Cre (KPC) modèle de souris de PDA récapitule la maladie humaine et est un outil précieux pour évaluer les thérapies pour l’immunothérapie résistante dans le cadre préclinique, mais le temps à l’début de tumeur est très variable. Les modèles orthotopiques chirurgicaux d’implantation de tumeur de PDA maintiennent les marques immunobiologiques du microenvironnement de tumeur tissu-spécifique de KPC (TME) mais exigent une procédure de temps-intensive et introduisent l’inflammation aberrante. Ici, nous utilisons un modèle orthotopic d’implantation orthotopic de tumeur ultrason-guidé (UG-OTIM) pour injecter non-invasivement kPC-dérivé des lignes de cellules de PDA directement dans le pancréas de souris. Les tumeurs d’UG-OTIM se développent dans le site endogène de tissu, récapitulent fidèlement des dispositifs histologiques du TME de PDA, et atteignent des tumeurs d’inscription-classées pour des études précliniques par quatre semaines après injection avec l’ensemencement minimal sur la paroi péritonéale. Le système UG-OTIM décrit ici est un modèle de tumeur rapide et reproductible qui peut permettre l’analyse à haut débit des combinaisons thérapeutiques nouvelles dans le TME murine de PDA.
L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDA) est une maladie notoirement agressive qui est réfractaire aux traitements actuels, avec un taux de survie lamentable de 5 ans de 9%1. PDA a récemment dépassé le cancer du sein pour devenir la troisième cause de mortalité liée au cancer aux États-Unis et devrait devenir la deuxième cause (derrière seulement le cancer du poumon) d’ici l’an 20302. Un certain nombre de caractéristiques caractéristiques de l’immunologiquement «froid» Microenvironnement tumoral PDA (TME) – y compris une forte infiltration des populations de cellules myéloïdes immunosuppressive3,4,5,6,7, dépôt stromal dense8,9,10,11, et une pénurie de lymphocytes T5,12,13-contribuer à l’échec des immunothérapies dans PDA14. À cette fin, l’utilisation d’un modèle animal cliniquement pertinent est un outil essentiel pour étudier l’efficacité de nouvelles combinaisons de médicaments pour les tumeurs immunologiquement froides in vivo.
Le KrasG12DMD/-génétiquement modifié ; Trp53R172HMD/-; Pdx-1 Cre (KPC) modèle de souris de PDA récapitule fidèlement les aspects cliniques saillants de la PDA humaine, y compris les moteurs moléculaires de la maladie et les caractéristiques histopathologiques15. Les tumeurs de KPC se développent spontanément dans les souris entièrement immunocompétentes, permettant l’interrogation des approches thérapeutiques comprenant la chimiothérapie16,17,immunothérapie18,19,20,21, et la thérapie de stroma-ciblage9,11,22invivo avant l’administration de ces drogues dans le cadre d’essai clinique. En dépit de ses nombreux points forts comme modèle préclinique de PDA, l’utilisation des souris de KPC est désavantagée par la progression fortement variable du développement spontané de tumeur pendant que le commencement de tumeur peut s’étendent de 4 à 40 semaines (exigeant ainsi l’entretien une grande colonie reproductrice)15. En outre, les souris KPC ont le potentiel pour les tumeurs primaires polyclonales23, et il ya un déclin rapide de la santé animale et l’augmentation des co-morbidités, y compris la cachexie et ascites que la maladie progresse15.
Une alternative au modèle spontané de souris KPC est d’utiliser un modèle d’implantation orthotopique de PDA24. L’implantation chirurgicale directe des lignées de cellules de tumeur dedans au site indigène de tissu est une méthode plus rentable et prévisible de récapituler le microenvironnement de tumeur de tissu-spécifique (TME) de PDA. L’implantation tumorale permet l’injection de lignées cellulaires tumorales clonales à des souris génétiquement rétrocroisées5, permettant aux souris hôtes avec des manipulations génétiques supplémentaires qui seraient longues à se reproduire dans le modèle de souris KPC. Cependant, l’implantation pancréatique de tumeur exige une procédure chirurgicale laborieuse-intensive qui introduit l’inflammation anormale au site de suture dans la paroi abdominale24,25,26, et inclut souvent une longue récupération postopératoire27,28,29.
Les progrès technologiques en imagerie par ultrasons à l’aide de transducteurs spécifiques aux rongeurs fournissent des images haute résolution en temps réel. Guidé par l’imagerie par ultrasons du mouvement de l’aiguille d’injection dans la cavité péritonéale, on peut spécifiquement implanter des cellules tumorales dans le pancréas, en tirant parti des avantages des injections de tumeur orthotopic en l’absence de l’implantation chirurgicale et de l’inflammation associée. Cette approche, appelée modèle orthotopic d’implantation orthotopic de tumeur ultra-guidée (UG-OTIM) a été précédemment établie dans un modèle xénogreffe du cancer pancréatique30 aussi bien que dans plusieurs autres modèles de cancer comprenant le sarcome d’Ewing, le neuroblastoma et le cancer de réservoirsouple 31,32.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer des injections ultrason-guidées des lignes de cellules de tumeur dedans au pancréas murine. Nous montrons les tumeurs résultantes récapitulent les dispositifs histologiques et immunologiques du TME de KPC et peuvent donc être employées pour étudier de nouvelles combinaisons thérapeutiques, y compris des immunothérapies, pour indiquer rapidement les traitements les plus prometteurs pour se déplacer dans les essais cliniques.
Nous montrons ici que l’utilisation de l’échographie à haute résolution pour diriger l’implantation des lignées cellulaires de PDA murine au site de tissu autochthonous est une alternative fiable aux systèmes de modèle orthotopic de KPC et chirurgicales. UG-OTIM produit des tumeurs biologiquement pertinentes qui conservent les dispositifs immunopathologiques de PDA avec un délai raccourci au diagnostic de tumeur et à la cinétique fiable de croissance de tumeur. L’injection guidée par ultrasons peut donc servir d’outil utile pour la production rapide de souris portant des tumeurs PDA orthotopiques implantées, permettant l’étude des combinaisons thérapeutiques dans un modèle cliniquement pertinent.
L’implantation guidée par ultrasons offre des améliorations importantes par rapport aux modèles standard d’investigation préclinique. Tout d’abord, cette procédure élimine la surveillance chrononutant des souris KPC pour le développement de tumeurs spontanées en implantant directement entièrement C57BL/6 cellules PDA rétrocroisées dans le pancréas murine. Deuxièmement, semblable aux injections orthotopiques chirurgicales traditionnelles, l’approche UG-OTIM permet le contrôle sur la ligne cellulaire injectée, y compris la sélection d’une ligne cellulaire monoclonale et/ou la manipulation ex vivo de la lignée cellulaire, ainsi que le contrôle sur l’hôte recevant l’implantation de cellules tumorales. Troisièmement, cette technique mini-invasive évite le travail ardu de la chirurgie de survie et contourne la période de récupération postopératoire compliquée pour les animaux ainsi que les signaux inflammatoires de la cicatrisation chirurgicale des plaies. Enfin, les tumeurs UG-OTIM – semblables à l’implantation chirurgicale – récapitulent le TME observé chez les souris de KPC, y compris l’infiltration basse de cellule T et l’infiltration élevée de macrophage. Ainsi, le modèle UG-OTIM conserve les dispositifs principaux des tumeurs de KPC sans les complications additionnelles qui retardent des investigations thérapeutiques dans le modèle spontané de KPC.
Un certain nombre d’étapes critiques dans le protocole sont la clé pour maîtriser le succès de la technique. L’expertise dans l’imagerie par ultrasons murine est essentielle pour cette procédure, mais la dextérité manuelle requise pour implanter avec succès les cellules dans le pancréas est un ensemble de compétences qui doivent être développés indépendamment. Pour les souris sur un cycle de lumière/obscurité de 12 heures, le jeûne des animaux pendant la nuit a assuré que l’estomac et les intestins étaient dégagés de n’importe quel aliment non digéré qui pourrait bloquer la vue du pancréas, du rein et de la rate par ultrasons. En outre, chaque lignée cellulaire utilisée pour l’injection orthotopique doit être titrée avant d’autres expériences pour comprendre la cinétique de croissance et de déterminer le potentiel métastatique33. Pendant l’injection, l’utilisation de forceps pour pincer la peau au site d’injection a créé la tension nécessaire pour perforer doucement par la peau et la paroi péritonéale. Une étape clé dans la procédure a été de guider soigneusement l’aiguille dans le pancréas sans perforer le tissu ou perforer un site hors cible comme la rate ou le rein. La confirmation d’un bolus liquide était le meilleur indicateur de l’injection réussie de cellules de tumeur dans le tissu approprié. Après l’injection, l’aiguille doit être retirée lentement afin de ne pas déranger le bolus liquide. Nous avons constaté qu’une série d’injections d’essai utilisant DMEM ou Trypan Blue a aidé à développer une maîtrise de la motricité fine nécessaire pour cette injection.
Au cours du dépannage de cette procédure, nous avons identifié un certain nombre de facteurs qui ont eu une incidence sur le succès du protocole. Dans les expériences d’essai, notre erreur la plus fréquente était perforation du rein pendant l’implantation, qui s’est produite plus fréquemment dans nos premières expériences suggérant que l’exercice régulier de cette compétence améliore la compétence. En outre, nous avons constaté que la confirmation de la présence d’un bolus liquide après injection de cellules tumorales par ultrasons et visualisation directe à l’autopsie pendant la phase de dépannage a amélioré la technique d’injection réussie. Si la formation d’une bulle n’est pas confirmée par échographie pendant l’injection, l’emplacement de l’aiguille peut être ajusté avant de déprimer complètement la seringue pour libérer le bolus restant des cellules tumorales. Nous avons également observé que les volumes de suspension injectés trop rapidement ont eu comme conséquence le déversement des cellules de tumeur dans la cavité péritonéale ou l’effondrement du bolus liquide dans le pancréas. Généralement, ces animaux ont continué à développer des tumeurs pancréatiques à l’exception des animaux n -7 qui n’ont montré aucune évidence de tumeur 4 semaines après injection. Ce résultat a été rapporté seulement dans nos premières tentatives (et 6/7 animaux ont été injectés avec un tigre bas des cellules de tumeur). Les souris qui ont des injections douteuses de cellules tumorales, ou nécessitant le repositionnement de l’aiguille, devraient être étroitement surveillées pour le développement des tumeurs en dehors du pancréas.
Les principales limites de la méthode guidée par ultrasons sont la disponibilité des instruments requis et la compétence technique associée à l’implantation tumorale. La procédure n’est pas complètement stérile, car la souris est injectée non stérilement sur la plate-forme d’ultrason, avec la seringue et la pointe d’aiguille passant par le gel d’ultrason. Bien que nous n’ayons vu aucune preuve d’infection chez les souris n’148 à travers un total de 8 expériences indépendantes depuis le lancement de ces études, il est possible qu’un agent infectieux pourrait entrer dans le pancréas par l’aiguille d’injection au cours de ce processus. Par conséquent, autant d’aspects du protocole que possible (y compris les gants, les surfaces d’ultrason, les boîtes à glace) devraient être pulvérisés avec du désinfectant ou de l’éthanol à 70 % afin de réduire l’exposition potentielle aux agents pathogènes. Une limitation supplémentaire du protocole actuel était l’absence de métastes utilisant la lignée cellulaire 4662 aux dilutions actuelles. Chaque lignée cellulaire utilisée dans le système UG-OTIM doit être titrée pour les taux de croissance souhaités ainsi que le potentiel métastatique33. Enfin, notre protocole actuel a établi des techniques pour injecter des cellules tumorales dans une suspension unicellulaire. Cependant, l’ajout d’un substrat de matrice extracellulaire pourrait être ajouté pour potentiellement améliorer l’établissement de tumeur et empêcher la fuite de cellules de tumeur (comme il est employé dans les modèles chirurgicaux d’implantation27,30,31,32). Ainsi, beaucoup des limitations de UG-OTIM peuvent être surmontées avec l’essai approprié des lignées cellulaires utilisées dans les injections orthotopic.
En résumé, le modèle UG-OTIM est une méthode précise d’injection dirigée par les tissus des cellules tumorales dans le pancréas murine. Cette technique d’implantation mini-invasive profite à la fois à l’investigateur et aux animaux en réduisant le temps de procédure, en minimisant les complications post-chirurgicales et en améliorant la précision de l’injection. Les tumeurs résultant des injections d’UG-OTIM conservent les dispositifs immunobiologiques caractéristiques des tumeurs spontanées de KPC, ont le temps fiable au démarrage de tumeur, et la cinétique reproductible de croissance de tumeur. Ainsi, le modèle UG-OTIM peut être utilisé d’une manière relativement à haut débit pour interroger les combinaisons thérapeutiques dans un cadre préclinique afin de révéler de nouveaux traitements pour les patients ayant les plus grands besoins cliniques non satisfaits.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Robert Vonderheide et tous les membres du laboratoire Vonderheide, tous membres du Pancreatic Cancer Mouse Hospital, le Dr Ben Stanger, le Centre de recherche sur le cancer du pancréas de l’Université de Pennsylvanie et Devora Delman discussions utiles. Ce travail est soutenu par le financement du Parker Institute for Cancer Immunotherapy Fellow Award (KTB) et du Pancréatique Cancer Research Center de l’Université de Pennsylvanie (CC).
50 mL Conicals | Thomas Scientific | 2602A26 | |
Blunt edged forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Cell Dissociation Buffer | Thermo-Fisher | 13151014 | |
Cotton Tipped swabs | Thermo-Fisher | 19062614 | |
Covidien Monoject 3/10mL, 29G X 1/2" | Thermo-Fisher | 8881600145 | |
Depilatory Agent | Amazon | Nair Body Lotion | |
DMEM | Thermo-Fisher | 10-566-016 | |
FBS | Gemini Bio-oroducts | 100-106 | |
Flask | Sigma-Aldrich | CLS430825 | |
Forceps (blunt edge) | Fine Science Tools | 11000-12 | |
Gauze | Fisher | 13-761-52 | |
Gentamicin | Thermo-Fisher | 15750060 | |
Induction Chamber | VetEquip | 941444 | |
Isofluorane | Penn Vet Supply | VED1350 | |
Isofluorane Vaporizer | VetEquip | 911103 | |
L-glutamine | Thermo-Fisher | 25030081 | |
Optixcare | MidWest Veterinary Supply | 052.50310.3 | |
Paper Tape | Medline | MMM1530Z5 | |
PBS | Thermo-Fisher | 14-190-250 | |
Slide warmer | C&A Scientific | XH-2001 | |
Sterilant (Clidox-S) | Fisher Scientific | NC0332382 (activator) NC9189926 (base) | Needs to be combined according to manufacturer's instructions |
Sterile Alcohol prep pad | Covidien | 6818 | |
Trypsin | Thermo-Fisher | 15090046 | |
Ultrasound gel | Thermo-Fisher | 03-34-1LT | |
Visualsonics Ultrasound Vevo 2100 | Visual Sonics | Vevo 2100 |