Dieses Protokoll enthält detaillierte experimentelle Schritte zur Etablierung einer dreidimensionalen In-vitro-Kultur von Blasentumororganoiden, die aus krebserregendem murinen Blasenkrebs gewonnen werden. Kulturmethoden wie Passaging, Gentechnik und orthotopische Transplantation von Tumororganoiden werden beschrieben.
Die Entwicklung fortschrittlicher Tumormodelle wird seit langem gefördert, da aktuelle Krebsmodelle Einschränkungen wie den Mangel an dreidimensionaler (3D) Tumorarchitektur und eine geringe Relevanz für menschlichen Krebs aufgezeigt haben. Forscher haben vor kurzem ein 3D-In-vitro-Krebsmodell entwickelt, das als Tumororganoide bezeichnet wird und die Eigenschaften eines nativen Tumors in einer Kulturschale nachahmen kann. Hier werden experimentelle Verfahren für die Etablierung von Blasentumororganoiden aus einem krebserregend-induzierten murinen Blasentumor, einschließlich Kultur, Passage und Aufrechterhaltung der resultierenden 3D-Tumororganoide in vitro, detailliert beschrieben. Darüber hinaus werden Protokolle zur Manipulation der etablierten Blasentumor-Organoidlinien für die Gentechnik mit Lentivirus-vermittelter Transduktion beschrieben, einschließlich optimierter Bedingungen für die effiziente Einführung neuer genetischer Elemente in den Tumor. Organoide. Schließlich wird das Verfahren zur orthotopischen Transplantation von Blasentumororganoiden in die Wand der murinen Blase zur weiteren Analyse angelegt. Die in diesem Artikel beschriebenen Methoden können die Etablierung eines In-vitro-Modells für Blasenkrebs zur Entwicklung besserer therapeutischer Möglichkeiten erleichtern.
Blasenkrebs ist der häufigste Harnwegskrebs, etwa 165.000 Patienten sterben jährlich1. Unter den verschiedenen Arten von Blasenkrebs, muskelinvasive surotheliale Karzinom zeigt einen aggressiven Phänotyp, und seine 5-Jahres-Überlebensrate ist niedriger als 50%2. Neue therapeutische Möglichkeiten für invasive urotheliale Tumoren wurden in den letzten Jahrzehnten nicht erweitert1.
Krebszelllinien wurden ausgiebig für das Arzneimittelscreening verwendet3. Obwohl günstige Ergebnisse bei zahlreichen Arzneimittelkandidaten in Krebszelllinien beobachtet wurden, werden schlechte Ergebnisse in klinischenStudien4 berichtet. Nach einer verstärkten Anpassung an in vitro zweidimensionale (2D) Kulturumgebungen ist es immer schwieriger geworden, native Tumoren in Zelllinien zu rekapitulieren. Tierkrebsmodelle oder von Patienten abgeleitete Tumor-Xenografts können verwendet werden, um die Einschränkungen zu beheben, die in Blasenkrebszelllinien beobachtet werden. Tierkrebsmodelle sind jedoch zeit- und ressourcenintensiv. Daher sind verbesserte Krankheitsmodelle seit Jahren auf Abruf und ein neuartiges Modellsystem, Organoide, wurde entwickelt, um die Mängel der bestehenden Modelle zu überwinden5.
Ein Organoid ist ein multizelluläres 3D-Konstrukt, das in vitro die physiologischen Eigenschaften seines entsprechenden In-vivo-Organs rekapitulieren kann. Normale und Tumor-Organoide können entweder aus pluripotenten oder adulten Stammzellen und primären Tumorzellen bzw.5,6abgeleitet werden. In den letzten Jahren, Tumor-Organoide wurden aus einer großen Anzahl von verschiedenen Tumorgewebe7, einschließlich Dickdarm8,9, Blase10, Bauchspeicheldrüse11,12, Prostata13, Leber14, und Brust15 Tumorgewebe. Solche Tumororganoide imitieren ihre ursprünglichen Tumoren phänotypisch und genetisch. Aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit In-vivo-Tumorgeweben und ihren zahlreichen praktischen Anwendungen haben Forscher sie als neuartige Krankheitsmodelle bei der Erforschung der Krebspathogenese übernommen.
Hier werden die Verfahren zur Etablierung von Tumororganoiden aus einem krebserregend-induzierten murinen invasiven Urotheltumor16 angelegt. N-Butyl-N-(4-Hydroxybutyl)-Nitrosamin (BBN) wird als Karzinogen verwendet, um invasives urotheliale Karzinom bei Mäusen17 zu induzieren und die Tumororganoide, die die pathologischen Eigenschaften von Mausmuskel-invasiven Blasentumoren aufweisen, werden aus dem BBN-induzierten murinen Blasenkrebs16nachgewiesen. Die Methode zur genetischen Manipulation der Tumororganoide wird anhand der lentivirusvermittelten Transduktion veranschaulicht, um ein Modellsystem zur Untersuchung der molekularen Grundlagen der Entwicklung von Blasenkrebs zu entwickeln. Darüber hinaus wird eine Methode zur orthotopischen Transplantation von Organoiden in eine Blase beschrieben, um die Rolle der einheimischen Blasenumgebung bei Blasenkrebs zu untersuchen.
Dieses Protokoll beschreibt die experimentellen Verfahren zur Kultur und Aufrechterhaltung von Blasentumororganoiden, die aus krebserregenden murinen Blasentumoren abgeleitet sind.
In diesem Protokoll gibt es mehrere experimentelle Schritte, in denen die Prozeduren möglicherweise eine Fehlerbehebung benötigen. Erstens ist die Anzahl der Tumorzellen, die zunächst gesät werden, ein kritischer Faktor, da eine geringe Anzahl von Tumorzellen in der Kultur (<2 x 104 Zellen) meist zum Zelltod aufgrund fehlender Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen führen. Im Gegensatz dazu führt der Beginn mit zu vielen Zellen (>5 x 104 Zellen) bei der Aussaat zu überfüllten Organoiden, was zu Schwierigkeiten beim Umgang mit Kulturen mit schlechtem Wachstum jedes Organoids führt. Es wird dringend empfohlen, dass mehrere Platten mit unterschiedlicher Anzahl von Zellen am Anfang etabliert werden, um die experimentellen Bedingungen zu optimieren. Die Identifizierung der richtigen Anzahl von Anfangstumorzellen ist entscheidend, um die höchste Zelllebensfähigkeit zu erreichen und erfolgreiche Blasentumor-Organoide zu etablieren. Auch in der Langzeitkultur von mehr als 2 Wochen ohne Passaging, die meisten Tumor-Organoide aufhören zu wachsen, möglicherweise aufgrund der unzureichenden Versorgung mit Nährstoffen im Zentrum der Organoide und die Erschöpfung des Wachstumsfaktors in der Kellermembranmatrix. Daher ist die rechtzeitige Subkultivierung von Organoiden ein entscheidender Schritt, um die Tumororganoidkultur aufrechtzuerhalten.
Zweitens ist die Produktion von hochtiter lentiviralen Partikeln entscheidend für die effiziente genetische Manipulation von Tumororganoiden. Um Probleme mit Virustitern zu beheben, wird dringend empfohlen, die Virustitter jedes Mal vor der viralen Transduktion zu bestimmen, da lentivirale Konstrukte dazu neigen, virale Partikel mit unterschiedlicher Effizienz zu produzieren. Wenn Tumororganoide nach einer Virusinfektion eine geringe Lebensfähigkeit aufweisen, ist es wahrscheinlich, dass die viralen Titter potenziell zu hoch sind. Es wird dringend empfohlen, geringere Menge an Virus in diesem Fall zu verwenden. Drittens, während der orthotopischen Transplantation von BBN-induzierten Blasentumororganoiden, ist es wichtig, die Integrität der Blasenwand zu erhalten. Für den Fall, dass die Injektion das Lumen der Blase erreicht, indem sie in die Blasenwandschicht eindringt, sollte das Experiment beendet und verworfen werden. Wenn möglich, wird die Überwachung des Blasentumorwachstums mit einem Ultraschall-Bildgebungssystem empfohlen.
Eine Einschränkung der aktuellen Techniken ist das Fehlen der Tumor-Mikroumgebung oder Stroma in diesen Organoiden. Um dieses Problem zu überwinden, wird dringend empfohlen, dass die orthotopische Transplantation von Tumororganoiden ein In-vivo-System verwendet, um die native Tumormikroumgebung nachzuahmen. In Zukunft wird es notwendig sein, 3D-In-vitro-Organoidsysteme zu entwickeln, die aus Tumororganoiden mit anderen Komponenten von Tumorstroma bestehen.
Eine der wichtigsten Implikationen unserer Technik ist, dass bei der orthotopischen Transplantation von Tumororganoiden nur 10 Blasentumor-Organoide Tumorwachstum in der Blase induzieren können. Im Vergleich zu den konventionellen Tumortransplantationsexperimenten, die 5 x 105–1 x 106 Einzelblasentumorzellen erfordern, sind unsere Methoden viel effizienter und robuster. Ein weiterer signifikanter Unterschied besteht darin, dass die Organoide mit verschiedenen lentiviralen Vektoren, wie z. B. lentiviralen Konstrukten, die Kurzhaar-RNA enthalten, dem CRISPR-Cas9-System oder Genen von Interesse diversifiziert werden können. Dies wären leistungsfähige Werkzeuge, um die aktuelle Organoid-Technologie hinzuzufügen. Insgesamt können die hier vorgestellten experimentellen Ansätze die Etablierung von In-vitro-Tumormodellen erleichtern, die unser Verständnis der Pathogenese von Blasenkrebs verbessern können, anstatt 2D-Blasenkrebszelllinien zu verwenden.
Diese Methode war in der Lage, Blasentumor-Organoide aus einem karzinogen-induzierten murinen Blasentumor abgeleitet zu etablieren. Der Artikel enthält eine Beschreibung der mit Lentivirus vermittelten experimentellen Verfahren, durch die die genetischen Veränderungen in Blasentumororganoiden eingeführt und stabil aufrechterhalten werden. Darüber hinaus ist ein Verfahren zur orthotopischen Transplantation von Tumororganoiden enthalten. In Kombination mit aktuellen In-vivo-Krebsmodellen wird diese Technik ein nützliches Werkzeug sein, um die molekulare Grundlage der Blasentumorigenese zu untersuchen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde durch Stipendien der National Research Foundation of Korea an K.S. unterstützt: NRF-2017R1A2B4006043, NRF-2017M3C7A1047875, NRF-2017R1A5A1015366, Creative Economy Leading Technology Development Programme (SF317001A), POSCO (2018Y060) das BK21 Plus Research Fellowship.
0.45 µm syringe filter (PES membrane) | Millipore | SLHP033RS | |
10 cm culture plate | Eppendorf | 0030-702-115 | |
90 mm Petri dish | SPL | 10090 | |
100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
24-well plate | Corning | 3526 | |
29 G 1/2 insulin syringe | SHINA | B299473538 | |
3 mL syringe | Norm-ject | N7.A03 | |
50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
A8301 | Tocris | 2939 | stock concentration: 25 mM |
Absolute ethanol | Daejung | 4023-2304 | |
Absorbable suture | Henry Schein | 039010 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo | 12634028 | |
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Thermo | A1049201 | |
B-27 | Gibco | 17504-044 | stock concentration: 50X |
BBN(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine) | Tokyo Chemical Industry | B0938 | |
Blue nylon 5/0-13mm | AILEE | NB521 | |
C57BL Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (nude mouse) | Charles River | 194 | |
Collagenase type I | Thermo | 17100017 | stock concentration: 20 mg/mL |
Collagenase type II | Thermo | 17100015 | stock concentration: 20 mg/mL |
Collagenase/dispase | Sigma | 10269638001 | stock concentration: 1 mg/mL |
Cyrovial | Corning | 430488 | |
DMEM(Dulbecco's modified minimum essential media) | Gibco | 11965-118 | |
DMSO(Dimethyl sulfoxide) | Sigma | D8418 | |
DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Welgene | LB 001-02 | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Healthcare | DIN: 02169428 | |
FBS(Fetal bovine serum) | Millipore | ES009B-KC | |
Glutamax | Gibco | 35050061 | 100X |
HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Welgene | BB001-01 | |
Isoflurane | Hana Pharm Co., Ltd. | ||
Ketoprofen (Anafen) | Merial | DIN: 02150999 | |
Matrigel growth factor reduced (GFR) Growth Factor Reduced (GFR) |
Corning | 354230 | use for organoid culture in plate |
Matrigel high concentration (HC) | Corning | 354248 | use for organoid transplantation |
1.5 mL microtube | Axygen | MCT-150-C | |
LT1 transfection reagent | Mirus Bio | MIR 2300 | |
murine EGF(epidermal growth factor) | Peprotech | 315-09 | stock concentration: 100 µg/mL |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | stock concentration: 200 mM |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | stock concentration: 1M |
Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
pCMV.R 8.74 | Addgene | 22036 | Packaging plasmid |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | 100X |
pMD2.G | Addgene | 12259 | Envelope plasmid |
Polybrene(hexadim ethrine bromide) | Sigma | H9286 | stock concentration: 2 µg/mL |
pSiCoR | Addgene | 11579 | Lentiviral plasmid |
Razor blade | |||
Saline buffer | JW Pharmaceutical | ||
SW41Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus | Millipore | 58656-2500KUCN | stock concentration: 250 KU/mL |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | |
Ultracentrifugation tube | Beckman Coulter | 331372 | |
Y-27632 dihydrochloride | Abmole | M1817 | stock concentration: 10 mM |