Dit protocol is voor de onbevooroordeelde detectie van weefsel-geassocieerde bacteriën in patiënten biopsieën door 16s rRNA in situ hybridisatie en confocale microscopie.
Visualisatie van de interactie van bacteriën met gastheer mucosale oppervlakken en weefsels kan waardevol inzicht geven in mechanismen van pathogenese. Terwijl visualisatie van bacteriële pathogenen in diermodellen van infectie kan vertrouwen op bacteriële stammen die zijn ontwikkeld om fluorescerende eiwitten zoals GFP te uiten, vereist visualisatie van bacteriën binnen het slijmvlies van biopsieën of weefsel dat is verkregen van menselijke patiënten een onbevooroordeelde methode. Hier beschrijven we een efficiënte methode voor de detectie van weefsel-geassocieerde bacteriën in menselijke biopsie secties. Deze methode maakt gebruik van fluorescerende in-situ hybridisatie (vissen) met een fluorescerend gelabelde universele oligonucleotide sonde voor 16S rRNA voor het labelen van weefselgeassocieerde bacteriën binnen blaas biopsie secties verkregen van patiënten die lijden aan recidiverende urineweginfectie. Door het gebruik van een universele 16S rRNA-sonde kunnen bacteriën worden opgespoord zonder voorafgaande kennis van soorten, geslachten of biochemische kenmerken, zoals lipopolysaccharide (LPS), die nodig zijn voor detectie door immunofluorescentie-experimenten. We beschrijven een compleet protocol voor 16S rRNA vis van biopsie fixatie tot Imaging door confocale microscopie. Dit protocol kan worden aangepast voor gebruik in bijna elk type weefsel en vertegenwoordigt een krachtig hulpmiddel voor de onpartijdige visualisatie van klinisch relevante bacteriële hostinteracties in het patiëntenweefsel. Bovendien kan dit protocol, met behulp van soorten of genera-specifieke sondes, worden aangepast voor de detectie van specifieke bacteriële pathogenen binnen het patiëntenweefsel.
De urinewegen, bestaande uit de urethra, blaas, urineleiders en nieren wordt voortdurend blootgesteld aan bacteriën die bestaan uit de urine-microbiome evenals binnenvallende uropathogenen, zoals uropathogene E. coli (UPEC), uit het maagdarmkanaal 1,2. Een laagje gehydrateerd slijm dat bestaat uit glycosaminoglycanen en een ondoorlatende plaque van geglycosyleerde uroplakin-eiwitten, uitgedrukt op het oppervlak van de oppervlakkige cellen, vormt een barrière die het blaas epitheel routinematig beschermt tegen invasie door aanhangers bacteriën3,4. Tijdens urineweginfectie (UTI), deze barrières worden verstoord of vernietigd, vergemakkelijken van gehechtheid aan en invasie van het blaas epitheel door uropathogene bacteriën5,6. Werk in Murine modellen is gebleken dat veel uropathogene bacteriën, met inbegrip van UPEC, Klebsiella pneumoniae, en enterococcus faecalis replicatieve intracellulaire Gemeenschappen (ibc’s) kunnen vormen binnen het cytoplasma van oppervlakkige cellen en stilstellende intracellulaire reservoirs (qirs) binnen overgangs epitheelcellen7,8,9. Hoewel UPEC is geïdentificeerd binnen de schuur epitheelcellen van humane UTI patiënten, was de interactie van uropathogenen met het blaas slijmvlies bij de mens niet eerder gevisualiseerd10.
We hebben een gemeenschappelijke techniek, fluorescentie in situ hybridisatie (Fish), aangepast om bacteriën te detecteren binnen het slijmvlies van blaas biopsieën die zijn verkregen bij postmenopauzale patiënten die Cystoscopie ondergaan met electrofulguratie van trigonitis (ceft) voor de gevorderde beheer van met antibiotica refractaire recidiverende UTI11. Met behulp van een universele sonde voor 16S rRNA, konden we objectief detecteren bacteriesoorten in verband met de blaas mucosa van terugkerende UTI patiënten en bepalen hun positie binnen de blaaswand12. De universele 16S rRNA nucleotide-sonde was eerder ontworpen om te richten op een geconcongeerde regio van de bacteriële 16S rRNA13, die overeenkomt met posities 388-355 van de E. coli 16S rRNA. De 16s rRNA en Scramble probe sequenties zijn eerder gevalideerd en gepubliceerd voor gebruik in de muis gastro-intestinale tractus14,15. De sequenties en eigenschappen van de sondes worden beschreven in tabel 1. Het is essentieel om twee opeenvolgende secties in dit protocol te gebruiken, een voor de 16S rRNA-sonde en één voor de Scramble Probe, om onderscheid te kunnen maken tussen het ware en het achtergrond signaal als het blaas epitheel, collageen en elastine vertonen autofluorescentie16 . In dit protocol zijn de 16S rRNA en Scramble probes ontworpen met fluorescerende Alexa Fluor 488 labels op zowel de 3 ‘ en 5 ‘ Termini via N-hydroxysuccinimide (NHS) ester koppelingen om het fluorescerende signaal te verhogen.
Hoewel dit protocol werd ontwikkeld voor gebruik op menselijke blaas biopsie secties, het kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik op paraffine-ingesloten secties van elk weefsel waar bacteriën worden verondersteld om te verblijven. In tegenstelling tot immunohistochemie-experimenten die gericht zijn op specifieke antigenen (bijv. lipopolysaccharide) op het bacteriële oppervlak, vereist deze methode geen voorafgaande kennis van antigenen uitgedrukt door de weefselgeassocieerde bacteriën10,17 . Gebruik van de universele 16S rRNA-sonde maakt een objectieve detectie van alle bacteriesoorten in het monster mogelijk, maar staat niet toe dat hun identiteit wordt bepaald. Om te bepalen van de identificatie van gedetecteerde bacteriën, soorten of genus-specifieke 16S of 23S rRNA sondes moeten worden gebruikt. Dit protocol zal ook niet detecteren schimmel pathogenen, zoals Candida albicans, geassocieerd met gastheer weefsel. Voor de detectie van schimmel pathogenen, 28S of 18S rRNA sondes moeten worden gebruikt18.
Hier beschrijven we een protocol voor de detectie van weefsel-geassocieerde bacteriën in menselijke blaas biopsieën door 16s rRNA FLSH. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor biopsieën uit andere weefsels, zoals het maagdarmkanaal of de huid, en kan worden uitgebreid tot weefsels die zijn geoogst uit verschillende model organismen van zoogdieren. Het hier beschreven protocol kan ook worden aangepast voor het gebruik van meervoudige fixatie (bv. formaline, ethanol, methacarn) en weefsel bereidingstechnieken (bijv. paraffine of hars ingebed, en cryopreserved weefsels). De dubbel gelabelde universele 16S rRNA sonde zorgt voor de onbevooroordeelde detectie van alle bacteriesoorten aanwezig in weefsel en kan waardevol inzicht geven in hoe pathogenen en de microbiota ruimtelijk omgaan met mucosale oppervlakken bij ziekte en gezonde Staten. Met behulp van bronnen zoals probeBase, PhylOPDb of de PROBE_DESIGN tool van het ARB softwarepakket voor de selectie of het ontwerp van soorten of genera-specifieke 16S of 23S rRNA sondes, kan dit protocol worden aangepast voor de detectie van specifieke bacteriesoorten of-geslachten binnen weefsel15,21,22. Een belangrijke toekomstige richting voor deze methode is multiplexing met behulp van soorten-of genera-specifieke sondes gelabeld met verschillende, discrete fluor Foren voor de evaluatie van microbiële diversiteit binnen de blaas mucosa.
De primaire beperking van deze methode voor gebruik op menselijke specimens is de beschikbaarheid van biopsied weefsel. Goedkeuring van de institutionele beoordelings Raad en geïnformeerde toestemming van de patiënt zijn vereist voor het verkrijgen van biopsieën en directe samenwerking met de clinicus die de procedure uitvoert is noodzakelijk voor een optimale monsterafname en toegang tot patiënt metagegevens. De CEFT-procedure zelf vernietigt het blaas epitheel, zodat we biopsie van deze gebieden konden rechtvaardigen vóór de procedure. Voor dit protocol is een rook afzuigkap of een passend ingerichte bioveiligheidskast vereist vanwege het gebruik van toxische xylenen in de deparaffinisatie stap en de noodzaak om gedurende de hele procedure een steriele omgeving te behouden. Voor dit protocol is een fluorescerende Microscoop, bij voorkeur confocale, met een 63x of een 100x objectief en geschikte filter sets voor visualisatie van Hoechst, Alexa-555 en Alexa-488 vereist. De representatieve resultaten afgebeeld in Figuur 1 werden gefotografeerd met behulp van een laser scanning confocale Microscoop. Vergelijkbare microscopen voor laserscannen moeten vergelijkbare afbeeldingen produceren. Dit protocol is beperkt door zijn vermogen om alleen weefsel-geassocieerde bacteriën te detecteren en niet, bijvoorbeeld, schimmels. Sondes specifiek de schimmel 18S of 28S rRNA moet worden gebruikt om schimmel pathogenen in weefsel18te identificeren.
Kritische stappen naar dit protocol omvatten het handhaven van een steriele omgeving gedurende de hele procedure en ervoor te zorgen dat het weefsel niet uitdroogt tussen hybridisatie en kleurings stappen. Als het weefsel uitdroogt tijdens de procedure, kan het signaal worden gedempt of kan het weefsel van de glijbaan vallen tijdens een wasstap. Het is ook essentieel om altijd twee seriële secties voor dit protocol te gebruiken — een voor de 16S rRNA probe en één voor de Scramble probe. Zonder deze controle kan het zeer moeilijk zijn om valse positieven te onderscheiden en kunnen de verkregen gegevens niet nuttig of informatief zijn. Als dit protocol wordt aangepast voor gebruik met een andere sonde dan de Universal 16S rRNA-sonde, moet worden gezorgd voor het selecteren van een geschikte hybridisatie temperatuur, ongeveer 5 °C lager dan de voorspelde smelttemperatuur van de sonde. Om de signaalintensiteit te behouden, mag het weefsel gedurende langere tijd niet aan licht worden blootgesteld nadat de sonde is toegevoegd en mag het niet overbelicht worden tijdens de microscopie. Ten slotte moeten tijdens de microscopie dezelfde instellingen voor het kanaal overeenkomend met de de, geconjugeerd aan de viskleuren, consistent worden gehouden tussen de experimentele (16s rRNA sonde) en de controle (Scramble probe) glaasjes. Het visualiseren van de ruimtelijke relatie van bacteriën binnen mucosale oppervlakken van patiënten afgeleide weefsels is essentieel voor het begrijpen en ontwikkelen van klinisch relevante hypotheses over de gastheer-pathogeen interacties onderliggende infectieziekte.
The authors have nothing to disclose.
We willen Kim Orth en Marcela de Souza Santos graag bedanken voor protocol advies en Amanda Arute voor technische ondersteuning. Dit werk werd deels gesteund door de Cecil H. en IDA Green Chair in Systems biologie Science in het bezit van K.P.
Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
0.22 micron syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |