虽然弯曲杆菌的粪便培养不精确,但它仍然被认为是识别的黄金标准。介绍了确定人类粪便中C.jejuni运输介质检测和生存极限的方法,并与一种精度更高的新免疫测定进行了比较。
从人类粪便诊断弯曲杆菌为基础的肠道疾病的文化需要几天的时间,等待,征税医生和病人的坚毅。一种文化也容易产生假阴性结果,因为在标本处理过程中随机丧失生存能力,其他粪便菌群的过度生长,以及传统媒体上几种致病性弯曲杆菌物种的生长不良。这些问题会混淆患者治疗的临床决策,并限制领域回答有关弯曲杆菌生长和感染的基本问题。我们描述了一个程序,估计细菌数量的下限,可以检测到的培养物和量化C.jejuni在用于运输这种脆弱生物的介质中生存的方法。了解此信息后,就可以为诊断测试设置临床相关的检测阈值,并解决未研究的问题:非症状殖民化是否普遍,是否与其他肠道病原体共同感染是常见的,或者如果细菌负荷与症状或严重的后遗症相关。该研究还包括测试1,552个潜在采集的患者腹泻粪便标本,这些标本最初按传统培养分类,并通过新的酶免疫测定进一步测试。然后,通过四种分子方法筛选阳性和分片标本,以分配真阳性或真实阴性状态。这5种非培养方法对所有48种阳性和分片标本进行了完全的一致,而该培养物的识别错误为14(28%)。被培养者错误识别的样本包括13个假阴性和1个假阳性样本。此基本协议可用于多个弯曲杆菌,并将允许确定在人类中产生肠胃炎症状的弯曲杆菌的数量,并更新患病率。
美国疾病控制和预防中心(CDC)最近公布的食源性疾病主动监测网络(FoodNet)监测计划报告2018年9723例实验室诊断弯曲杆菌感染病例1.这意味着弯曲杆菌病例报告比 2015-2017 1 年增加了12%。在全球范围内,弯曲杆菌是最常见的细菌肠道感染2。然而,每年发生的基于弯曲杆菌的肠道疾病的数量被怀疑少报3。这种低估是可以预测的,因为大多数患者只能恢复中度不适,没有治疗。然而,对于症状较重或有较高严重疾病风险的患者,以及寻求医疗护理的患者,粪便培养是评估弯曲杆菌是否是导致其苦恼的病原体的最常见方法。
对于弯曲杆菌来说,凳子文化尤其麻烦。最常见的致病性有机体,C.jejuni,C.大肠杆菌,C.上升,和C.拉里,是微航空嗜血5。这意味着细菌一旦暴露在空气中,就会以随机的、未知的速度死亡。因此,标本采集与培养设置之间的时间成为不受控制的变量,无法通过培养来检测可行的弯曲杆菌。
对于粪便标本的直接培养,弯曲杆菌的缓慢生长也是一个问题。弯曲杆菌菌落非常小,即使在48小时的孵育后,也很容易被粪便基质中的相互竞争的生物覆盖。含有抗生素的板,大多数菌株的C.jejuni和C.大肠杆菌是耐药广泛使用,因为抗生素抑制生长许多(但不是全部)竞争的粪便细菌,允许更好的可视化弯曲杆菌菌落6。然而,其他弯曲杆菌物种,如C.拉里和C.上升状体对其中一些抗生素敏感,要么生长不良,要么根本不生长。这导致这些对抗生素敏感的物种7的弯曲杆菌感染报告不足。
有第三个原因,为什么弯曲杆菌的文化可能是不准确的。细菌,当压力,可能仍然可行,但可以成为”不可培养的“8。根据定义,这意味着培养不会检测样品中的细菌。发生的频率尚不清楚8。
鉴于这些潜在的文化问题,我们使用了多种比较参考方法,使错误的区域性结果不会使单个比较器测定结果显得不准确。之所以选择培养方法(如弯曲杆菌-选择性板、输送介质、气体产生小袋),是因为它们在粪便标本培养的临床实验室中广泛使用。
这里描述的培养协议是因为人们所知,人类粪便中文化所能检测到的弯曲杆菌jejuni数量最低。虽然已公布对家禽粪便11中存在菌群形成单位(CFU)的估计,但这些结果不能等同于人类粪便,因为弯曲杆菌是鸡的共性,不会引起腹泻。需要这些基本信息来确定将对人类产生肠胃炎症状的弯曲杆菌的数量,并比较菌株或物种之间的毒性。
这里描述的培养方法是建立在简单,广泛使用的技术和材料在大多数实验室10。分析和精心设计的样本相结合,为粪便培养物提供了临床相关检测阈值的新信息。此外,通过5次单独测定对培养结果的裁定加强了弯曲杆菌粪便培养错误识别患者样本很大一部分的结论。EIA 和分子测定作为对照组非常有用,因为它们都基于不同的原理(抗原与抗体与DNA扩增相互作用),而且重要的是,它们不依赖于细菌的生存能力。请注意,用于这些研究的EIA测定已经得到了很好的验证,并已证明完全同意4个分子测试12。
弯曲杆菌的培养特别麻烦,敏感性报告范围从60-76%19,20,从它30%的失败率未能检测真阳性标本在这里可见。当培养数据为阴性时,人员可以预期控制EIA和分子测试通常会产生阳性结果。
协议中最关键的步骤是确定相互竞争的粪便菌群之间的针点菌落。在接近检测阈值时,具有交替零和非零聚位计数估计值(例如,2、0、1、0、0)并不罕见。必须认识到,培养阈值将是一系列浓度,而不是特定的 CFU/mL。然而,对1×106 CFU/mL粪便作为培养检测下限的估计与报告相比,受感染的人类每克粪便21下泄106至109个弯曲杆菌。抗生素或加盘的变化和个别粪便标本中不可避免的变化无疑会改变阈值。此协议应支持增长介质的改进。
关于培养检测限制的第一个信息,使得为诊断测试设定临床相关阈值成为可能,并奠定了解决弯曲杆菌未研究的无症状运输22、23问题,或者如果细菌负荷与症状或严重后遗症相关的问题所需的微生物基础。
The authors have nothing to disclose.
这些研究由TECHLAB公司资助。
Anaerobic 3.5L Jar | Thermo Fisher | HP0031A | |
AnaeroGRO Campylobacter Selective Agar | Hardy Diagnostics | AG701 | |
Bacto Brain Heart Infusion | BD Biosciences | 237500 | |
Bacto Protease Peptone | Life Technologies Corp | 211684 | |
Basic Fuchsin | Fisher Scientific | B12544 | |
BBL Trypticase Peptone | Life Technologies Corp | 211921 | |
C. coli Type strain | ATCC | 33559 | |
C. jejuni Type strain | ATCC | 33560 | |
CampyGen gas generating system sachet | Thermo Fisher | CN0025A | |
Campylobacter QUIK CHEK | TechLab, Inc. | T5047 / T31025 | |
Cary-Blair transport medium | Fisher Scientific | 23-005-47 | |
Coli Roller Sterile plating beads | Millipore Sigma | 71013 | |
Dilution Buffer | Anaerobe Systems | AS-908 | |
Fetal bovine serum | Equitech-Bio, Inc | SFBM30 | |
Sodium bisulfite | Sigma-Aldrich | 243973 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
Spectrophotometer cuvettes | USA Scientific | 9090-0460 |