Este artigo apresenta um protocolo de centrifugação de velocidade diferencial em combinação com a centrífuga de gradiente de densidade para separar as mitocôndrias dos tecidos humanos de câncer de ovário e controlar os tecidos ovarianos para análise quantitativa de proteômica, resultando em uma amostra mitocondrial de alta qualidade e análise proteômica quantitativa de alta produção e alta reprodutibilidade de um proteoma mitocondrial de câncer de ovário humano.
O câncer de ovário é um câncer ginecológico comum com alta mortalidade, mas mecanismo molecular pouco claro. A maioria dos cânceres de ovário são diagnosticados em estágio avançado, o que dificulta seriamente a terapia. As mudanças mitocondriais são uma marca registrada dos cânceres de ovário humano, e as mitocôndrias são os centros de metabolismo energético, sinalização celular e estresse oxidativo. Insights aprofundados sobre as mudanças do proteoma mitocondrial em cânceres de ovário em comparação com o controle do tecido ovariano beneficiarão a compreensão aprofundada dos mecanismos moleculares do câncer de ovário e a descoberta de biomarcadores eficazes e confiáveis e alvos terapêuticos. Um método eficaz de preparação mitocondrial juntamente com uma tag isobaric para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) proteômica quantitativa são apresentados aqui para analisar o câncer de ovário humano e controlar proteomas mitocondriais, incluindo centrifugação de velocidade diferencial, centrifugação de gradiente de densidade, avaliação de qualidade de amostras mitocondriais, digestão de proteínas com trippsina, rotulagem de iTRAQ, fracionação de troca de cacionária forte (SCX), cromatografia líquida (LC), espectrometria de massa tandem (MS/ EM), análise de banco de dados e análise quantitativa de proteínas mitocondriais. Muitas proteínas foram identificadas com sucesso para maximizar a cobertura do proteoma mitocondrial do câncer de ovário humano e para alcançar o perfil de proteína mitocondrial expressa diferencialmente em cânceres de ovário humano.
O câncer de ovário é um câncer ginecológico comum com alta mortalidade, mas claro mecanismo molecular1,2. A maioria dos cânceres de ovário são diagnosticados em estágio avançado, o que dificulta seriamente a terapia. As mudanças mitocondriais são uma marca registrada dos cânceres de ovário humano, e as mitocôndrias são os centros de metabolismo energético, sinalização celular e estresse oxidativo3,4,5,6,7. Insights aprofundados sobre as mudanças do proteoma mitocondrial em cânceres de ovário em comparação com o controle do tecido ovariano beneficiarão a compreensão aprofundada dos mecanismos moleculares do câncer de ovário e a descoberta de biomarcadores eficazes e confiáveis e alvos terapêuticos. Metabolismo mitocondrial tem sido proposto e reconhecido como um alvo para a terapia do câncer, e terapia anticondírica pode finalmente ser muito benéfico para prevenir a recorrência e metástase do câncer8. Perfil metabólico individual também já é praticado como uma ferramenta útil para estratificação do câncer e estratégias preditivas9,10.
O objetivo a longo prazo desta pesquisa é desenvolver e usar um método quantitativo de proteômica mitocondrial para estudar o câncer de ovário para esclarecimento de alterações mitocondriais proteoma entre câncer de ovário e controle de tecidos ovarianos, e suas alterações de rede molecular a partir de um ângulo multi-ômicos sistemático 11,12, o que resultará na descoberta de biomarcadores moleculares orientados para mitocôndrias 13 para esclarecimento dos mecanismos moleculares do câncer de ovário,12, o que resultará na descoberta de biomarcadores moleculares direcionados às mitocôndrias13 para esclarecimento dos mecanismos moleculares do câncer de ovário, previsão, e tratamento personalizado de pacientes com câncer de ovário. Tags isóbaricas para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) rotulagem3,4 são um método eficaz para quantificar as mudanças de proteína mitocondrial. A preparação de amostras mitocondriais de alta qualidade do câncer de ovário humano e controle dos tecidos ovarianos são o pré-requisito para a análise quantitativa iTRAQ de proteomas mitocondriais3. Preparação mitocondrial juntamente com proteômica quantitativa iTRAQ tem sido usada com sucesso em programas de pesquisa de longo prazo sobre o câncer de ovário humano proteoma mitocondrial, incluindo o estabelecimento de mapas de referência proteoma mitocondrial3, a análise de perfis mitocondriais expressos diferencialmente4,14 e modificações pós-translacionais, incluindo a fosforialização, que já resultou na descoberta de importante via de sinalização mudanças de rede em cânceres de ovário humano5, incluindo alterações no metabolismo energético4,metabolismo lipídico, e mitopgia via sistemas3.
Estudos anteriores descobriram que a centrifugação de velocidade diferencial em combinação com a centrifugação de gradiente de densidade é um método eficaz para isolar e purificar as mitocôndrias do câncer de ovário humano e controlar os tecidos ovarianos3,4,5,14. A rotulagem iTRAQ juntamente com forte troca de cromação (SCX) cromatografia líquida (LC)-espectrometria de massa em tandem (MS/MS) é a técnica-chave para detectar, identificar e quantificar as proteínas das amostras mitocondriais preparadas.
Aqui, protocolos detalhados para a preparação mitocondrial juntamente com a proteômica quantitativa iTRAQ são descritos. Estes têm sido utilizados com sucesso na análise de proteomas mitocondriais de tecido de câncer de ovário humano. Os protocolos incluem a preparação de amostras, centrifugação de velocidade diferencial, centrifugação de gradiente de densidade, avaliação de qualidade de amostras mitocondriais, digestão de proteínas com trippsina, rotulagem de iTRAQ, fracionação SCX, LC, MS/MS, pesquisa de banco de dados e análise quantitativa de proteínas mitocondriais. Além disso, este protocolo traduz-se facilmente para analisar outros proteomas mitocondriais do tecido humano.
Alterações mitocondriais são uma marca registrada do câncer de ovário. A preparação de amostras mitocondriais de alta qualidade do câncer de ovário humano e tecidos de controle para proteômica quantitativa em larga escala beneficia a compreensão aprofundada da função mitocondrial na patogênese do câncer de ovário e alterações na rede molecular mitocondrial, e ajuda a esclarecer seu mecanismo molecular para a descoberta subsequente da terapia alvo e biomarcadores eficazes com base em mitocôndrias<sup cl…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Hunan Provincial Hundred Talent Plan (para X.Z.), o Xiangya Hospital Funds for Talent Introduction (to XZ), a National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81572278 e 81272798 to XZ), as doações da China “863” Plan Projeto (Grant No. 2014AA020610-1 para XZ), e a Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 14JJ7008 to XZ). X.Z. concebeu o conceito para o presente manuscrito, obteve os dados de proteômica quantitativa iTRAQ de amostras de mitocôndrias, escreveu e revisou o manuscrito, coordenou o trabalho pertinente e foi responsável pelo apoio financeiro e correspondente Trabalho. H.L. preparou amostras de mitocôndrias. A S.Q. participou de trabalhos parciais. X.H.Z participou de escrever e editar o idioma inglês. N.L. analisou os dados de proteômica iTRAQ. Todos os autores aprovaram o manuscrito final.
BCA protein assay kit | Vazyme | E112 | BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml). |
Bovine serum albumin (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, ≥98% |
Centrifuge | XiangYi | TDZ4–WS | |
CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, suitable for electrophoresis, ≥98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
Diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ≥98% |
DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
Easy nLC | Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific) | ||
Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥97 .0% |
Homogenizer | SilentShake | HYQ-3110 | |
iTRAQ reagent kit | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ Reagents–Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A | |
Low-temperature super-speed centrifuger | Eppendorf | 5424R | |
Mannitol | Macklin | M813424-100G | Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency. |
MASCOT search engine | Matrix Science, London, UK; version 2.2 | ||
Nagarse | Solarbio | P9090 | |
N-hydroxysuccinimide (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥97.0% (T) |
Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor | Solarbio | P0100-1ML | PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain. |
Potassium chloride | Macklin | P816354-25G | Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776°C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute. |
Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, London, UK | ||
PVDF membrane | Millipore | 05317 | It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 µm pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes. |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | ||
SCX column | Sigma | 58997 | It is 5-μm particle size, length 5cm × i.d. 4.6mm (Supelco). |
Sodium orthovanadate (V) | Macklin | S817660-25G | Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution. |
Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec reagent grade, 99% |
Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagent, ≥99.0% |
Tris base | Sigma | 10708976001 | TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25°C. |
Trypsin (cell culture use) | Gibco | 25200-056 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. |
Urea | Sigma | U5378-100G | powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture |