Bu protokol, Caenorhabditis elegansbağırsak geçirgenliği ölçmek için nasıl açıklar. Bu yöntem bağırsak bakterileri ve ev sahibi arasındaki etkileşim ile ilgili bağırsak sağlığı temel biyolojik araştırma ve sızıntılı bağırsak sendromu ve inflamatuar barsak hastalıkları nın tedavisi için probiyotik ve kimyasal ajanları belirlemek için tarama için yararlıdır.
Yaşayan organizmalarda, bağırsak hiperpermeability birçok inflamatuar barsak hastalıklarına yol açan ciddi bir belirtidir (IbDs). Caenorhabditis elegans, kısa ömrü, şeffaflığı, maliyet etkinliği ve hayvan etiği sorunlarının eksikliği nedeniyle yaygın olarak bir tahsin sistemi olarak kullanılan memeli olmayan bir hayvan modelidir. Bu çalışmada, c. elegans’ın yüksek işlemli görüntü analiz sistemi ile bağırsak geçirgenliği üzerine farklı bakterilerin ve 3,3′-diindolylmethane (DIM) etkilerini araştırmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Solucanlar farklı bağırsak bakterileri ile enfekte edildi veya 48 saat dim ile birlikte tedavi edildi ve floresan isotiyoyanat ile beslenen (FITC)-dextran gecede. Daha sonra, bağırsak geçirgenliği floresan görüntüleri ve solucan cisimleri içindeki floresan yoğunluğu karşılaştırılarak incelendi. Bu yöntem aynı zamanda hayvan modelinde bağırsak geçirgenliğini etkileyen probiyotik ve patojenik bağırsak bakterileri belirlemek için potansiyele sahip olabilir ve bağırsak geçirgenliği ve bağırsak sağlığı üzerinde zararlı veya sağlık teşvik kimyasalların etkilerini incelemek için etkilidir. Ancak, bu protokol aynı zamanda genetik düzeyde bazı önemli sınırlamalar vardır, özellikle hangi genlerin hastalığı kontrol etmek için değiştirilir belirlemek için, Bu yöntem çoğunlukla fenotipik belirlenmesi için kullanılır çünkü. Buna ek olarak, bu yöntem tam olarak hangi patojenik substratların inflamasyona neden olduğunu belirlemek veya enfeksiyon sırasında solucanların bağırsaklarının geçirgenliğini artırmakla sınırlıdır. Bu nedenle, mutant bakteri ve nematodların moleküler genetik mekanizmasının araştırılması nın yanı sıra bakterilerin kimyasal bileşen analizi de dahil olmak üzere daha derinlemesine çalışmalar, bağırsak geçirgenliğini belirlemede bakteri ve kimyasalların işlevini tam olarak değerlendirmek için gereklidir.
Bağırsak geçirgenliği bağırsak mikrobiyotası ve mukozal bağışıklık ile ilgili ana engellerden biri olarak kabul edilir ve bağırsak mikrobiyota modifikasyonları, epitel bozukluğu veya mukus tabakası değişiklikleri gibi çeşitli faktörlerden etkilenmesi muhtemeldir1. Son kağıtlar bağırsak hücretabakası2 genelinde floresan akı oranları analiz ederek kültürlü insan bağırsak hücrelerinin bağırsak geçirgenliğini ölçmek için etkili protokoller bildirdin 2 , ama daha az araştırma kağıtları nematodlarda bağırsak geçirgenliğini ölçmek için uygun bir prosedür mevcut, Özellikle C. elegans, FITC-dextran boyama kullanarak.
Nil kırmızısı3 ve erioglaucine disodyum (veya Şirin tayini) 4,5kullanarak C. elegans bağırsak geçirgenliğini ölçmek için iki temsili protokol vardır. Bu protokolde, Nil kırmızısı (MW = 318,37) ve erioglaucin disodyum (MW = 792,85) çok daha yüksek molekül ağırlığına sahip FITC-dextran (ortalama molekül ağırlığı 10.000) kullanıldı. FITC-dextran, Nil kırmızısı veya erioglaucine disodyum boyalarından bağırsak tabakası yoluyla emilen karbonhidratlar gibi gerçek makromoleküler besinlere daha benzer. Erioglaucine disodyum (mavi Şirin boya) ile beslenen C. elegans bağırsak geçirgenliği kolayca floresan mikroskopi olmadan değerlendirilebilir. Ancak Şirin tahlillerinde, bağırsak geçirgenliğinin kantitatif analizi standardizasyon eksikliği nedeniyle zordur ve elle değerlendirilmelidir4,5. Nil kırmızısı tetkik durumunda, Nil kırmızısı da hücrelerde lipid damlacıkları lekeler, Hangi C. elegansbağırsak geçirgenliği tam belirlenmesi ni engelleyebilir6. Bu protokoller, spesifik olmayan lipid boyamakaçınArak çeşitli bağırsak bakteri ve kimyasallar ile tedavi Edilen C. elegans bağırsak geçirgenliğinin hızlı ve kesin kantitatif analizini sağlar.
C. elegans biyolojik alanlarda uygun fiyat, kolay manipülasyon, sınırlı hayvan etiği sorunları ve hızlı deneme 7için yararlı olan kısa ömrü nedeniyle tipik bir modeldir. Özellikle C. elegans genomunun tamamı yayınlandıktan sonra C. elegans genomundaki genlerin yaklaşık %40’ının insan hastalıklarına neden olan genler için ortolog olduğu bulunmuştur8. Ayrıca, şeffaf vücut hücresel olayları araştırmak ve hücre biyolojisi floresan uygulamaları için avantajlı organizma içinde gözlem sağlar, örneğin, DAPI veya immünohistokimya ile kök hücre boyama9. C. elegans genellikle bağırsak mikrobiyota ve konak arasındaki etkileşimi incelemek için deneysel bir hayvan olarak kullanılır; buna ek olarak, C. elegans tarama için kullanılır sağlık teşvik probiyotik bakteriler10,11,12 yanı sıra diyet kimyasallar bağırsak sağlığını teşvik13,14.
Pseudomonas aeruginosa ve Enterococcus faecalis olumsuz gastrointestinal sistemi etkileyen iyi bilinen bağırsak bakterileri, bağırsak sistemi özellikle kolon epitel hücreleri15,16. Bu nedenle, bu bakterilertarafından tetiklenen bağırsak geçirgenliğinin ölçülmesi, bakteriyel inflamasyon ve enfeksiyonun neden olduğu hasarı geri kazanabilen ve azaltabilecek yeni ilaçların taranması ve geliştirilmesi için gereklidir. Bu protokolde, bu bağırsak bakterilerinin C. elegansbağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerini test ettik.
Ayrıca C. elegansbağırsak geçirgenliği üzerinde kimyasallar test etmek için optimize edilmiş bir protokol rapor. Bu amaçla, dim indole-3-karbinol elde edilen bir biyoaktif metabolit bileşik olduğu için bir model kimyasal olarak 3,3′-diindolylmethane (DIM) kullanılan, Brassica gıda tesislerinde mevcut olan, ve farelerde IBD üzerinde tedavi edici etkileri olduğu bildirilmiştir17,18. Buna ek olarak, son zamanlarda DIM hem kültürlü insan bağırsak hücrelerinde bağırsak geçirgenliği disfonksiyonu yanı sıra model nematode C. elegans19geliştirir keşfetti.
Bu çalışmada üç farklı deneysel koşul kullandık. İlk olarak, farklı bakterilerin, P. aeruginosa ve E. faecalis’in bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerini ölçtük(Şekil 1). İkinci olarak, canlı ve ısıya bağlı P. aeruginosa’nın bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerini ölçtük(Şekil 2). Üçüncü olarak, Dim ‘in (bir model kimyasal) P. aeruginosa ile beslenen C. elegans’ın bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerini ölçtük(Şekil 3).
Bu çalışmanın amacı, çeşitli bağırsak bakterileri ile tedavi ile de değişen C. elegansbağırsak geçirgenliğini ölçmek optimize protokoller geliştirmek oldu yanı sıra kimyasallar ile.
Otomatik floresan mikroskobu ve kantitatif görüntü analizini birleştiren C. elegans’ta bağırsak geçirgenliğini belirlemek için bu yeni yöntem kullanılarak, bağırsak mikroorganizmalarının veya kimyasallarının neden olduğu farklar özellikle C. elegans bağırsağında invivo olarak belirlenebilir. Bu protokol bağırsak geçirgenliği araştırmaları için yararlıdır ve rahatlığı ve kolay manipülasyonu nedeniyle reaktif oksijen türlerinin (ROS) stres koşulları altında belirle…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Kore Bilim ve Teknoloji Enstitüsü intramural araştırma hibe (2E29563) tarafından desteklenmiştir.
3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
Cholesterol | Sigma | C3045 | |
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |