Patientenabgeleitete organoide Kulturen des pankreatischen duktodalen Adenokarzinoms sind ein schnell etabliertes dreidimensionales Modell, das epitheliale Tumorzellkompartimente mit hoher Genauigkeit darstellt und translationale Forschung entoliert. Hier bieten wir detaillierte Methoden zur Etablierung und Vermehrung von Organoiden sowie zur Durchführung relevanter biologischer Assays mit diesen Modellen.
Pankreas-Duktodas-Adenokarzinom (PDAC) gehört zu den tödlichsten Malignitäten. Kürzlich wurden Organoidkulturmethoden der nächsten Generation beschrieben, die die dreidimensionale (3D) Modellierung dieser Krankheit ermöglichen. Patientenabgeleitete Organoidmodelle (g.U.) können sowohl aus chirurgischen Proben als auch aus kleinen Biopsien isoliert werden und sich schnell in der Kultur bilden. Wichtig ist, dass Organoidmodelle die pathogenen genetischen Veränderungen, die im Tumor des Patienten festgestellt wurden, erhalten und die Behandlungsreaktion des Patienten vorhersagen und so translationale Studien ermöglichen. Hier bieten wir umfassende Protokolle zur Anpassung des Gewebekultur-Workflows zur Untersuchung von 3D-, Matrix-Eingebetteten, Organoidmodellen. Wir beschreiben Methoden und Überlegungen zur Isolierung und Verbreitung primärer PDAC-Organoide. Darüber hinaus beschreiben wir, wie maßgeschneiderte organoide Medien im Labor hergestellt und qualitätskontrolliert werden. Schließlich beschreiben wir Assays zur nachgelagerten Charakterisierung der Organoidmodelle wie Isolierung von Nukleinsäuren (DNA und RNA) und Arzneimitteltests. Wichtig ist, dass wir kritische Überlegungen für die Implementierung der organoiden Methodik in einem Forschungslabor liefern.
Pankreas-Duktodas-Adenokarzinom (PDAC) ist eine tödliche Erkrankung, die durch eine späte Diagnose bei den meisten Patienten, einen Mangel an wirksamen Therapien und eine daraus resultierende niedrige 5-Jahres-Gesamtüberlebensrate gekennzeichnet ist, die unter 10%1bleibt. Nur 20% der Patienten werden mit einer lokalisierten Krankheit diagnostiziert, die für den kurativen chirurgischen Eingriff geeignet ist2,3. Die übrigen Patienten werden in der Regel mit einer Kombination von Chemotherapeutika behandelt, die bei einer Minderheit der Patienten wirksam sind4,5. Um diesen dringenden klinischen Bedürfnissen gerecht zu werden, arbeiten die Forscher aktiv an Früherkennungsstrategien und der Entwicklung wirksamerer Therapien. Um die klinische Übersetzung wichtiger Entdeckungen zu beschleunigen, verwenden Wissenschaftler gentechnisch veränderte Mausmodelle, von Patienten abgeleitete Xenografts, monolayer Zelllinien und zuletzt Organoidmodelle6.
Dreidimensionale epitheliale Organoidkultur mit Wachstumsfaktor und Wnt-Ligand-reichen Bedingungen zur Stimulierung der Proliferation von untransformierten Vorläuferzellen wurden zuerst für den Mausdarmbeschrieben 7 und wurden schnell an normales menschliches Bauchspeicheldrüsengewebe angepasst8. Zusätzlich zu normalen duktalen Gewebe, Organoid-Methodik ermöglicht die Isolierung, Expansion, und Studie des menschlichen PDAC8. Wichtig ist, dass die Methode die Etablierung von Organoiden aus chirurgischen Proben sowie Feine und Kernnadelbiopsien unterstützt, so dass Forscher alle Stadien der Krankheit9,10untersuchen können. Interessanterweise rekapitulieren patientenabgeleitete Organoide gut beschriebene Tumortranskriptomik-Subtypen und können die Entwicklung von Präzisionsmedizinplattformen9,11ermöglichen.
Aktuelle Organoidprotokolle für PDAC ermöglichen die erfolgreiche Erweiterung von mehr als 70% der Patientenproben von chemonaiven Patienten9. Hier stellen wir die Standardmethoden unseres Labors zur Isolierung, Erweiterung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten PDAC-Organoiden vor. Andere ORGANoide PDAC-Methoden wurden beschrieben12,13 aber es wurde kein Vergleich dieser Methode durchgeführt. Da diese Technologie relativ neu ist und schnell voranschreitet, erwarten wir, dass sich diese Protokolle weiterentwickeln und verbessern werden; die Prinzipien der Gewebehandhabung und der organoiden Kultur werden jedoch weiterhin nützlich sein.
Hier stellen wir aktuelle Protokolle zur Isolierung, Erweiterung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten PDAC-Organoiden vor. Unsere derzeitige Erfolgsquote bei der Etablierung einer organoiden Kultur liegt bei über 70 %; daher sind diese Methoden noch nicht perfektioniert und werden sich im Laufe der Zeit verbessern und weiterentwickeln. Die Stichprobengröße sollte in Betracht gezogen werden, da PDAC eine geringe neoplastische Zellulizität hat. Folglich enthalten kleine Proben nur wenige Tumorzellen und erze…
The authors have nothing to disclose.
Wir sind dankbar für die Unterstützung des UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository and Tissue Technology Shared Resource, Der Mitglieder des Lowy-Labors und der UC San Diego Department of Surgery, Division of Surgical Oncology. AML wird großzügig unterstützt von NIH CA155620, einem SU2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), und Spendern des Fund to Cure Pancreatic Cancer.
12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
12 well plates | Olympus | 25-106 | |
15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
37 °C CO2 incubator | |||
37 °C water bath | |||
384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Automated cell counter | |||
B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
Chloroform | Sigma | C2432 | |
Computer | |||
CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
DMEM | ATCC | 30-2002 | |
DNase I | Sigma | D5025 | |
Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
Excel | For data analysis | ||
Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
GraphPad Prism | For data analysis | ||
HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
Laminar flow tissue culture hood | |||
Luminometer | |||
L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
p1000 pipette with tips | |||
p200 pipette with tips | |||
PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
Tissue culture centrifuge | |||
Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
Zeocin | ThermoFisher | R25001 |