Dit werk presets een geavanceerd protocol om nauwkeurig te beoordelen tumor laden door detectie van groene fluorescerende eiwitten en bioluminescentie signalen, alsmede de integratie van kwantitatieve moleculaire detectie techniek.
Triple-negatieve borstkanker (TNBC) is een agressief borstkanker subtype met beperkte therapeutische opties. In vergelijking met patiënten met minder agressieve borsttumoren is de 5-jarige overlevingskans van TNBC-patiënten 77% vanwege hun karakteristieke resistente fenotype en gemetastaseerde last. Tegen dit doel, murine modellen zijn opgericht gericht op het identificeren van nieuwe therapeutische strategieën beperking van TNBC tumorgroei en uitgezaaide verspreiding. Dit werk beschrijft een praktische gids voor de TNBC orthotopopisch model waar MDA-MB-231 borstkankercellen opgehangen in een kelder membraan matrix worden geïmplanteerd in de vierde borstvet pad, die nauw bootst de kanker cel gedrag bij de mens. Meting van tumoren door remklauw, longmetastase beoordeling via in vivo en ex vivo imaging, en moleculaire detectie worden besproken. Dit model biedt een uitstekend platform om therapeutische werkzaamheid te bestuderen en is vooral geschikt voor de studie van de interactie tussen de primaire tumor en distale gemetastaseerde sites.
Ongeveer een op de acht vrouwen in de Verenigde Staten zal invasieve borstkanker te ontwikkelen tijdens haar leven, en 10%−20% van deze vrouwen zal worden gediagnosticeerd met de agressieve triple negatieve borstkanker (TNBC) subtype. Terwijl primaire laesies in de meeste gevallen operatief kunnen worden verwijderd, maken de subklinische micrometastase en chemoresistentie het een hardnekkige ziekte. Belangrijk is dat de meeste patiënten met uitgezaaide TNBC uiteindelijk terugvallen, zelfs als ze een behandeling ondergingen in het vroege stadium1. Dus, kanker heterogeniteit, micrometastase, en therapeutische resistentie zijn drie grote uitdagingen het beperken van de succesvolle klinische uitkomst van TNBC-patiënten. Daarom is er een dringende noodzaak om de polymorfe moleculaire achtergrond van TNBC beter te begrijpen en effectieve therapeutische middelen te ontwikkelen die gemetastaseerde ziekten beperken.
Tumormetastase is een proces met meerdere stappen waarbij de tumorcel zijn micro-omgeving controleert en overneemt om zijn eigen verspreiding te bevorderen via membraanafbraak en tumorcelontsnapping uit de primaire laesie, via binnenkomst in (d.w.z. intravasatie) en exit uit (d.w.z. extravasatie) de vasculatuur, en uiteindelijk aanpassing en kolonisatie binnen distale beddenweefsel 2. Diermodellen zijn ontwikkeld om borstkankermetastase te bestuderen, waarbij twee methoden vaak worden toegepast: directe bloedcirculatieinjectie en orthotopische implantatie. Algemeen gebruikte methoden voor directe bloedcirculatie injectie omvatten staart ader injectie, terwijl andere benaderingen, waaronder directe hartinjectie3,directe herseninjectie4, en directe lever injectie5 zijn ook gebruikt. De directe bloedcirculatie injectie wordt vaak aangeduid als een kunstmatige metastase model, dat is snel en gemakkelijk, maar minder fysiologisch nauwkeurig omdat het omzeilt tumor ontsnappen aan de primaire laesie en intravasatie6,7,8. In vergelijking met directe injectiemodellen duurt het orthotopische borstkankermodel langer voor het optreden van detecteerbare gemetastaseerde laesies in afgelegen organen zoals de long, maar het is fysiologisch relevanter omdat het het multistep gemetastaseerde proces nauw nabootst zoals het bij mensen voorkomt. Belangrijk is dat een studie van 20139 de staartaderinjectie en orthotopische modellen vergeleek en vond dat de borstkankercellen die in de staartader werden geïnjecteerd en die geïsoleerd werden van uitgezaaide laesies na de injectie van staartaders vergelijkbare mondiale genexpressieprofielen vertoonden. Het globale genexpressieprofiel van orthoplaatselijk geïnjecteerde borstkankercellen was daarentegen dramatisch anders dan dat van uitgezaaide longlaesies als gevolg van orthoplaatselijk geïnjecteerde cellen9. Deze waarnemingen suggereren dat het orthotopische model fysiologisch relevanter is, omdat de gemetastaseerde laesies een selectieproces ondergaan dat vergelijkbaar is met het meerstapsproces van metastase zoals het bij de mens voorkomt.
Dit werk beschrijft een orthotopopische borstkanker (MDA-MB-231-Luc/GFP) model in nude muizen dat werd geoptimaliseerd in ons laboratorium voor imaging detectie technieken, alsmede de identificatie van nieuwe biomarkers en de ontwikkeling van gerichte chemotherapeutische middelen.
Voor de studie van TNBC bij dieren zijn twee murinemodellen ontwikkeld: de MDA-MB-231 menselijke borstadenoomcellen in immuungecompromitteerde muizen (d.w.z. athymische naaktmuizen, NSG-muizen) en de 4T1 bij immuun-competente BALB/c-muizen. Beide modellen hebben hun voordelen. De keuze van het diermodel voor een studie hangt af van de onderzoeksdoelen. Bijvoorbeeld, de MDA-MB-231 model is een menselijke TNBC cellijn geteeld in immuungecompromitteerde muizen die immuunonderdrukte menselijke borstkanker patiënten bootst. Aan de andere kant, de invasieve fenotype van orthotopische 4T1 triple-negatieve murine borstkankercellen in BALB / c muizen nauw bootst het uitgezaaide proces als het optreedt in fase IV menselijke borstkanker patiënten. In tegenstelling tot de intraveneuze celinjectie benadering, menselijke MDA-MB-231 borstkankercellen werden op dezelfde manier geïnjecteerd in de borst vet pad11,12 in de orthotopische borstkanker model11,13. De langere tumorgroei en het verworven uitgezaaide vermogen zijn fysiologisch relevanter, dus het is geen kunstmatig gemetastaseerd kankermodel4,14. Zo’n spontane metastase model nauw bootst de ontwikkeling van menselijke borstkanker, behalve voor de initiatie fase. Dit is een cruciaal model voor in vivo drugscreening en therapeutische werkzaamheidsbeoordeling bij uitgezaaide borstkanker.
De tumor implantatie plaats in de muis speelt een cruciale rol in het verstrekken van een micro-omgeving die tumorgroei en de selectie van gemetastaseerde fenotype vergelijkbaar met die welke optreedt bij de mens ondersteunt. De proximale lymfeklier en de aanwezigheid van vetweefsel zijn de belangrijkste factoren die de progressie van borstkankerbeïnvloeden 15,16. Bij een menselijke patiënt zijn de lymfeklier en het vetweefsel beide belangrijke factoren die van invloed zijn op de maligniteit en incidentie van borstkanker17,18,19. Zo kan de selectie van de juiste anatomische locatie voor de injectieplaats de relevantie van het tumormodel in vergelijking met de menselijke ziekte sterk beïnvloeden. Deze studie gebruikte de vierde borstklier als de implantatieplaats voornamelijk als gevolg van de bovengenoemde eisen en dat het anatomisch toegankelijker en gemakkelijker te manipuleren is.
Verschillende tumor volume berekeningsmethoden zijn beschikbaar, en een onderzoeker kan kiezen welke ze geschikt achten. Het algoritme geselecteerd voor deze studie is gebaseerd op de bevindingen van Faustino-Rocha et al., die verschillende tumor volume berekeningformules vergeleken en concludeerde dat de onderstaande formule is de meest nauwkeurige20.
Keldermembraanmatrix is een belangrijke extracellulaire matrix die wordt gebruikt in verschillende in vitro21 en in vivo22,23 testen. Er zijn tegenstrijdige rapporten22,24,25 over de invloed van de kelder membraan matrix op xenograft maligniteit. Het lijkt alleen de oorspronkelijke vestiging van de xenograft te beïnvloeden en heeft verder geen effect op de groei van xenograft25. Voor de beschreven xenograft-implantatie werd de keldermembraanmatrix gemengd met de kankercellen om de viscositeit van de cel/gelmix voorafgaand aan implantatie te verhogen. De aanwezigheid van de keldermembraanmatrix vermindert het verlies van mengoplossing van de injectieplaats en houdt de mixoplossing op de implantatieplaats, waardoor de uniformiteit van het geïmplanteerde xenograft-volume toeneemt.
De MDA-MB-231 cellijn is een kwaadaardige vereeuwigde menselijke borst adenocarcinoma cellijn en is een populair instrument in borstkanker onderzoek vanwege zijn triple-negatieve status. Het gebruik van dual reporters (luciferase en GFP) cellijn zorgt voor meer flexibiliteit in het hanteren van de in vivo en ex vivo imaging. Het is algemeen vastgesteld dat het bioluminescentiesignaal een grotere gevoeligheid, dieptedetectie en superieur contrast (signaal-ruisverhouding) heeft dan GFP-signalen. Hierdoor is het een veel gebruikte beeldvormingsmodaliteit voor beeldvorming in het hele lichaam. Helaas wordt de detectie van bioluminescentie beperkt door een smal tijdvenster (~15−20 minuten na de injectie) waarbij de signaaldetectie lineair is. BLI signaal vermindert snel wanneer de dieren worden geëuthanaseerd. Dit wordt een experimenteel ontwerpprobleem als veel muizen geëuthanaseerd moeten worden en het oogsten van meerdere weefsels of organen nodig is. In deze studies werd bloed geoogst door directe hartpunctie, de hersenen, primaire tumor, long, en getroffen lymfeklier werden onderzocht in 40 muizen. Tegen de tijd dat de organen werden geoogst en klaar voor ex vivo beeldvorming, het bioluminescentie signaal was niet op te sporen. Daarom is GFP-detectie in deze situaties meer geschikt. De emissie van het GFP-signaal bevindt zich in het zichtbare bereik en bij deze golflengten is de signaalabsorptie als gevolg van bloed (d.w.z. hemoglobine) aanzienlijk hoger. Ook autofluorescentie in het zichtbare bereik als gevolg van NADH, lipo-pigmenten, en flavins resulteert in een aanzienlijke achtergrond die het moeilijk maakt om onderscheid te maken tussen een low-level GFP-signaal en autofluorescentie achtergrond. Het gebruik van een multispectrale fluorescentie imaging benadering in plaats van traditionele filter-pair imaging en het gebruik van spectrale unmixing algoritmen helpt identificeren echte GFP signaal in het orgaan van belang. Door de sterke punten van bioluminescentiebeeldvorming in het hele lichaam in vivo detectie en multispectrale GFP-beeldvorming in de ex vivo orgaan/weefselevaluaties te combineren, kunnen kwantificeerbare gegevens worden gemaximaliseerd in een groot cohort van muizen.
Het maakt niet uit welke aanpak is geselecteerd voor een dierstudie, het extraheren van al het bloed voorafgaand aan het ophalen van organen/weefsels wordt ten zeerste aanbevolen, vooral voor studies gericht op de gemetastaseerde belasting. Dit protocol detecteert GFP signalen van de hele bloed monsters verkregen van de muizen (gegevens niet getoond) in de orthotopische borstkanker model door real-time PCR testen. Het minimaliseren van het bloedvolume in organen/ weefsels vermindert het vals-positieve signaal in de doelorganen.
Tot slot, de orthotopische borstkanker model met behulp van de MDA-MB-231-Luc/ GFP cellen is een zeer relevant dier model dat nauw bootst de menselijke TNBC patiënt aandoening. Dit model is essentieel voor het bestuderen, monitoren en beoordelen van therapeutische werkzaamheid in een tumormicroomgeving vergelijkbaar met mensen. Het gebruik van dual reporter cellijnen verder verbetert de uitvoerbaarheid van deze orthotopische borstkanker model.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag de steun van de Intramural Research Program van de National Institutes of Health, National Cancer Institute, Bethesda MD, Kanker en Ontsteking Programma, en de Frederick National Laboratory – Small Animal Imaging Program erkennen, Leidos Biomedical Research, Inc, Frederick Maryland, USA.
Bouins Solution | Sigma | HT10132-1L | Lung metastatic nodule staining |
D-Luciferin, Potassium Salt | GoldBio | LUCK-1G | Luciferase substrate |
DNAzol | ThermoFisher | 10503027 | DNA extraction Kit |
Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
homogenizer | Virtis | Cyclone Virtishear | For tissue homogenization |
IVIS SPECTRUM scanner | Perkin Elmer | fluorescence and BLI imaging system | |
Maestro GNIR-FLEX fluorescence scanner | Perkin Elmer | fluorescence imaging system | |
MatriGel Matrix | Corning | 356234 | Store at -20C and keep old (4 C) when in use. |
MDA-MB-231 / Luciferase-2A-GFP Stable Cell Line | GenTarget | SC044 | Dual Reporter human breast cancer cell line |
Microscope | ThermoFisher | EVOS | histology image capture |
Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher | 10010049 | rinse buffer |
Primer3 | MIT | Primer Design | |
Prism | GraphPad | Statistical Analysis Software | |
Puromycin | ThermoFisher | A1113803 | Antibiotics |
RPMI 1640 media | ThermoFisher | 61870127 | Culture media |
SeniFAST SYBR Lo-ROX kit | Bioline | BIO-94020 | Fast Real-Time PCR Reagent |
StepOne Plus Real-Time PCR system | ThermoFisher | Real-Time PCR machine |