הקמה ואפיון של המעי הקטן נוירואנדוקרינים הגידול האנדוקרינית
Summary
גידולים נוירואנדוקריניים (רשתות) מקורם בתאים נוירואנדוקריניים של הרכס העצבי. הם הולך ומאתגר לאט לתרבות. אנו מציגים אסטרטגיה חלופית לגידול רשתות מהמעי הקטן על ידי הקפדה עליהם כספרואידים. הספרואידים הללו יש המעי הקטן סמנים נטו יכול לשמש בדיקות סמים.
Abstract
קטן גידולים נוירואנדוקריניים (SBNETs) הם סוגי סרטן נדירים שמקורם בתאי enterochromaffin של הבטן. מחקר בתחום זה היה מוגבל כי מעט מאוד החולה נגזר שורות ברשת SBNET נוצרו. תאים SBNET מובחנת היטב הם איטיים הגדלים וקשה להפיץ. קווי התאים הבודדים שהוקמו אינם זמינים, ולאחר זמן בתרבות לא ניתן להמשיך לבטא את המאפיינים של תאי NET. יצירת קווי תא חדש יכול להימשך שנים רבות מאז SBNET תאים יש זמן הכפלה ארוכה ושלבי העשרה רבים נחוצים כדי לחסל במהירות חלוקת סרטן הקשורים באופן מהיר. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו פרוטוקול התרבות SBNET תאים מפני גידולים שהוסרו בניתוח כמו spheroids ב מטריצה החילוץ (ECM). ECM צורות מטריצה תלת ממדית העוטף בתאי SBNET ומחקה את הגידול מיקרו הסביבה לאפשר לתאי SBNET לצמוח. כאן, אנו לאפיין את שיעור הצמיחה של SBNET spheroids מתוארים שיטות כדי לזהות סמנים SBNET באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence ואימונוהיסטוכימיה כדי לאשר כי spheroids הם תאי גידול נוירואנדוקריניים. בנוסף, השתמשנו ב-SBNET spheroids לבדיקת רעילות ציטופצין של rapamycin.
Introduction
קטן גידולים נוירואנדוקריניים (SBNETs) מקורם תאים enterochromaffin של המעי הדק. למרות ש-SBNETs ידועים בדרך כלל כשהם גדלים לאט, הם בדרך כלל מגרורות לכבד1. בעוד הסרת כירורגי או אבלציה הגידול יכול להיחשב במקרים רבים, הישנות היא כמעט אוניברסלית, ולכן, טיפול רפואי ממלא תפקיד חשוב בניהול. מאמצים עצומים הושקעו כדי ליצור חדש שורות SBNET תאים עבור בדיקות סמים. עם זאת, היתה מעט מאוד הצלחה. רק 6 שורות של תאי sbnet (krj-I, CND2, GOT1, P-sts, L-sts, H-sts) דווחו2,3,4,5; ולמרבה הצער קו תא אחד כבר לא מבטא סמנים נטו6 ושלושה אחרים sbnet תאים קווי (krj-I, L-Sts, H-sts) היו נחושים להיות נגזר lymphoblasts השתנה במקום רשתות7. כדי להאיץ את זיהוי התרופות לצורך התמקדות בבקרי גבול, יש צורך בשיטות חלופיות לבדיקת סמים מחוץ לרשת.
כאן, אנו מנצלים את הזמינות של SBNETs מחדש והקמנו דרך לתרבות אלה בעלי מטופלים שנוצרו על ידי המטופל כספרואידים הגדלים ב-ECM. המטרה הכוללת של כתב היד הזה היא לתאר שיטה לתרבות SBNET כתלת-מימדי (3D) תרבות והליכי חלוקה לרמות כדי לאפיין את הספרואידים לשמירת סמנים SBNET על ידי immunofluorescence כתמים ואימונוהיסטוכימיה.
בנוסף, אנו מדגימים כיצד אלה מזהי SBNET הניתנים לשימוש לבדיקת ההשפעה של rapamycin, תרופה נגד סרטן עבור רשתות8. הרציונל מאחורי פרוטוקול זה הוא לפתח שיטה חדשה לגדל בתאי SBNET בתוך מבחנה ולהשתמש בהם לבדיקת סמים. היתרון של טכניקה זו על השיטה המסורתית של הקמת קו SBNET cell היא כי תרבויות תלת-ממד של Sbnet ניתן להשיג במהירות ובדיקות סמים ניתן לעשות בתוך 3 שבועות. מסנני SBNET יכולים לשמש כמודל לביצוע מסכי סמים מחוץ לרשת כדי לזהות תרופות חדשות עבור מטופלים מסוג SBNET. מאז SBNET קווי התאים אינם זמינים באופן נרחב, 3D תלת-ממד של SBNET spheroids יכול לשמש כמודל חדש בתחום החוץ לחקר בקרי Sbnet וניתן לשתף בין מדענים בשדה.
Protocol
Representative Results
Discussion
גידולים 3D הגידול הפכו משאב רב ערך עבור בדיקות תרופות טרום קלינית15. הגידול שונים אורגנואיד ביואידים הוקמו לאחרונה מסרטן השד וסרטן הערמונית גידולים16,17. במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לתרבות SBNET כמו spheroids ושיטה פשוטה ומהירה כדי לאמת את התרבוי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים P50 CA174521 (למען י. י. האו ו-בליצי). P.H. האוזן הוא הנמען של הפרס P50 CA174521 הקריירה תוכנית שיפור.
Materials
| Anti-rabbit FITC | Jackson ImmunoResearch | 11-095-152 | Secondary antibody couple to a green fluorophore |
| Antigen Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | Solution at pH 9 for preparing slides for IHC |
| Autostainer Link 48 | Agilent Dako | Not Available | Automated system for antibody staining |
| Cell freezing container | Thermo Scientific | 5100-0001 | Container to for freezing cells |
| CellSence | Olympus | Version 1.18 | Computer software for using fluorescent microscope |
| Chromogranin A antibody | Abcam-45179 | RB-9003-PO | Antibodies for IF |
| Chromogranin A antibody (clone LK2H10) | Thermo Scientific | MA5-13096 | Antibodies for IHC |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | Medium for tissue preparation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | Medium for organoid cultures |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for dissolving drug |
| DNAse | Sigma | DN25 | Enzyme for digesting tumor tissue |
| Ethidium Homodimer | Chemodex | CDX-E0012-T1E | DNA and RNA binding dye |
| FBS | Gibco | 16000044 | Reagent for culture media |
| Fluorescent microscope | Olympus | CKX35 | Microscope for taking pictures of SBENT spheroids |
| Glutamine | Gibco | A2916801 | Reagent for culture media |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.51 | Computer software for image analysis |
| Insulin | Sigma | I0516 | Reagent for culture media |
| Matrigel | Corning | 356235 | Matrix to embed and anchore organoids |
| Mounting medium (VECTASHIELD) | Vector Laboratories | H-1200 | Fixative for labelled-cells with a nuclear stain |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reagent for culture media |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Reagent to fix cells |
| PEN/STREP | Gibco | 15140-122 | Reagent for culture media |
| PT Link | Agilent Dako | Not Available | Automated system to prepare slides for IHC staining |
| Rapamycin | Alfa Aesar | J62473 | Drug that can inhibit NET growth |
| Secondary antibodies for IHC | Agilent Dako | K8000 | Secondary antibodies for IHC using Polymer-based EnVision FLEX system |
| SSTR2 antibody | GeneScritp | A01591 | Antibodies for IF |
| SSTR2 antibody (clone UMB1) | Abcam | ab134152 | Antibodies for IHC |
| Synaptophysin antibody | Abcam | 32127 | Antibodies for IF |
| Synaptophysin antibody (clone DAK-SYNAP) | Agilent Dako | M7315 | Antibodies for IHC |
| TritonX | Mallinckrodt | 3555 KBGE | Reagent to permeablize cells |
| Y-2763 ROCK inhibitor | Adipogen | AG-CR1-3564-M005 | To improve SBNET spheroid viability after freeze thaw |
References
- Maxwell, J. E., Sherman, S. K., Howe, J. R. Translational Diagnostics and Therapeutics in Pancreatic Neuroendocrine Tumors. Clinical Cancer Research. 22, 5022-5029 (2016).
- Pfragner, R., et al. Establishment of a continuous cell line from a human carcinoid of the small intestine (KRJ-I). International Journal of Oncology. 8, 513-520 (1996).
- Kolby, L., et al. A transplantable human carcinoid as model for somatostatin receptor-mediated and amine transporter-mediated radionuclide uptake. American Journal of Pathology. 158, 745-755 (2001).
- Van Buren, G., et al. The development and characterization of a human midgut carcinoid cell line. Clinical Cancer Research. 13, 4704-4712 (2007).
- Pfragner, R., et al. Establishment and characterization of three novel cell lines – P-STS, L-STS, H-STS – derived from a human metastatic midgut carcinoid. Anticancer Research. 29, 1951-1961 (2009).
- Ellis, L. M., Samuel, S., Sceusi, E. Varying opinions on the authenticity of a human midgut carcinoid cell line–letter. Clinical Cancer Research. 16, 5365-5366 (2010).
- Hofving, T., et al. The neuroendocrine phenotype, genomic profile and therapeutic sensitivity of GEPNET cell lines. Endocrine Related Cancer. 25, 367-380 (2018).
- Moreno, A., et al. Antitumor activity of rapamycin and octreotide as single agents or in combination in neuroendocrine tumors. Endocrine Related Cancer. 15, 257-266 (2008).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11, 1724-1743 (2016).
- Saito, Y., et al. Establishment of Patient-Derived Organoids and Drug Screening for Biliary Tract Carcinoma. Cell Reports. 27, 1265-1276 (2019).
- Park, S. J., et al. Detection of bone marrow metastases of neuroblastoma with immunohistochemical staining of CD56, chromogranin A, and synaptophysin. Applied Immunohistochemisty and Molecular Morphology. 18, 348-352 (2010).
- Clifton-Bligh, R. J., et al. Improving diagnosis of tumor-induced osteomalacia with Gallium-68 DOTATATE PET/CT. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98, 687-694 (2013).
- Clinton, J., McWilliams-Koeppen, P. Initiation, Expansion, and Cryopreservation of Human Primary Tissue-Derived Normal and Diseased Organoids in Embedded Three-Dimensional Culture. Current Protocols in Cell Biology. 82, 66 (2019).
- Markovits, J., Roques, B. P., Le Pecq, J. B. Ethidium dimer: a new reagent for the fluorimetric determination of nucleic acids. Analytical Biochemistry. 94, 259-264 (1979).
- Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, 1092-1100 (2017).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172, 373-386 (2018).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communication. 9, 2404 (2018).
- Singh, S. P., et al. SSTR2-based reporters for assessing gene transfer into non-small cell lung cancer: evaluation using an intrathoracic mouse model. Human Gene Therapy. 22, 55-64 (2011).
