Time-Lapse 2D Изображение фагоцитарной активности в M1 Макрофаг-4T1 Мышь Mammary Карцином Клетки в ко-культур
Summary
Макрофаг фагоцитной активности против раковых клеток, в частности 4T1 мыши молочных клеток карциномы, был изображен в этом исследовании. Была создана и наблюдалась модель сокультуры живых клеток с использованием сочетания флуоресцентной и дифференциальной контрастной микроскопии помех. Эта оценка была изображена с помощью программного обеспечения для визуализации для разработки многоточечного видео.
Abstract
Опухолевые макрофаги (TAMs) были определены в качестве важного компонента для роста опухоли, вторжения, метастази и устойчивости к терапии рака. Тем не менее, опухолевые макрофаги могут быть вредны для опухоли в зависимости от микроокружения опухоли и могут обратимо изменять свои фенотипические характеристики, либо антагонизировать цитотоксическую активность иммунных клеток или усиливая противоопухолевую реакцию. Молекулярные действия макрофагов и их взаимодействие с опухолевыми клетками (например, фагоцитоз) не были широко изучены. Таким образом, взаимодействие между иммунными клетками (M1/M2-подтип TAM) и раковыми клетками в микроокружении опухоли в настоящее время находится в центре внимания исследований иммунотерапии рака. В настоящем исследовании, модель живой клеточной кокультуры индуцированных макрофагов M1 и мыши ныхциномы 4T1 карциномы клетки была разработана для оценки фагоцитарной активности макрофагов с помощью замедленного видео функция с использованием фазового контраста, флуоресцентные, и дифференциальные помехи контраста (DIC) микроскопии. Настоящий метод может наблюдать и документировать многоточечную живую визуализацию фагоцитоза. Фагоцитоз 4T1 клеток макрофагов M1 можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии перед окрашиванием 4Т1 клеток с carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). В настоящее время издание описывает, как сокультуры макрофагов и опухолевых клеток в одной визуализации блюдо, поляризовать M1 макрофагов, а также записывать многоточечные события макрофагов, охватывающих 4T1 клеток в течение 13 ч культуры.
Introduction
Макрофаги являются первой линией иммунной защиты и играют определенную роль в организации иммунных реакций против патогенных микроорганизмов и посторонних материалов, включая раковые клетки. Они являются специализированным фагоцитом, который разрушает и избавляется от нежелательных частиц в организме. Макрофаги способствуют защитные функции, такие как очистка апоптотические клетки и микроорганизмы и вербовка других иммунных клеток1. Макрофаги могут различаться на два различных типа, M1 и M2 макрофаги, в ответ на экологические сигналы2. M1-поляризованные макрофаги (т.е. классически активированные макрофаги) активируются цитокиновым интерфероном-Я (IFN-я) и липополисахаридами (LPS) и участвуют в воспалительной реакции, расчистке патогенов, эффективном фагоцитозе и опухолевом иммунитете3,4. Макрофаги M2 тесно связаны с опухолевыми макрофагами (TAMs) и обладают противовоспалительными и опухолевыми свойствами4.
Фагоцитоз, производный от древнегреческого (фагейн), что означает “пожирать”, (kytos), что означает “клетка”, и -osis, что означает “процесс”5. Фагоцитоз – это процесс, опосредованный рецепторами, в ходе чего фагоциты (включая макрофаги, моноциты и нейтрофилы) убивают и поглощают вторгающиеся патогены, очищают посторонние частицы и очищают апоптотический клеточный мусор. Опухолевые макрофаги (TAMs) находятся в строми в различных опухолях, включая рак молочной железы, и имеют про-опухолевые функции6,7, что приводит к резистентности к фагоцитозу. Детальный механизм фагоцитоза опухолевых клеток макрофагов пока не понятен.
Это исследование представляет собой двухступенчатый метод: 1) 4T1 мыши молочных клеток карциномы и M1-поляризованных макрофагов cocultured, и 2) фагоцитарной активности макрофагов оценивается с помощью живой-клеточной видеомикроскопии. CFSE флуоресцентный краситель был использован для испачкать 4T1 мыши молочных клеток карциномы. Пятна этикетки 4T1 клетки, чтобы отличить их от cocultured M1 макрофагов в рамках одной визуализации блюдо. RAW 264.7 макрофаги поляризуются с LPS и IFN-З в фенотип M1. Для обеспечения полной поляризации была проведена иммуностогирование анти-iNOS антителами, спряжение к FITC. Впоследствии, многоточечный ряд замедленного изображения был приобретен для наблюдения за несколькими событиями, в том числе фагоцитоз, в рамках кокультуры.
Более глубокое понимание взаимодействий между опухолевыми клетками и макрофагами может привести к потенциальной иммунотерапии рака. Визуализация в реальном времени предлагает детальное представление о клеточной динамике в обстановке в реальном времени и используется для изучения миграции клеток, фенотипического скрининга, апоптоза и цитотоксичности8,9 в неврологии, биологии развития и открытии наркотиков. Хотя предлагаемой опухолью в этом исследовании является рак молочной железы, метод также может быть применен к нескольким клеткам-мишеням и различным клеткам-эффекторам.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный протокол требует двух шагов: 1) кокультуры 4T1 мыши клеток карциномы и M1-поляризованных макрофагов, и 2) оценка макрофагов фагоцитной активности с использованием замедленной микроскопии. Сокультура живых клеток широко используется в фагоцитозных и миграционных анализах. Модел…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была финансово профинансирована Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. Мы хотели бы поблагодарить Агро-Биотехнологический институт, Малайзия (ABI) лаборатории, и микроскопии изображений объекта. Особая благодарность Мохду Даниэлю Хазиму за помощь в редактировании и записи экспериментального видео для этой работы.
Materials
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. . M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
