Summary

Bakterielles Peptid-Display zur Auswahl neuartiger Biotinylatierungsenzyme

Published: October 03, 2019
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Summary

Hier stellen wir eine Methode zur Auswahl neuartiger Varianten der E. coli-Biotin-Proteinligase BirA vor, die ein bestimmtes Zielpeptid biotinylatiert. Das Protokoll beschreibt die Konstruktion eines Plasmids zur bakteriellen Darstellung des Zielpeptids, die Erzeugung einer BirA-Bibliothek, die Auswahl und Charakterisierung von BirA-Varianten.

Abstract

Biotin ist eine attraktive posttranslationale Modifikation von Proteinen, die ein leistungsstarkes Tag für die Isolierung und Detektion von Proteinen bietet. Die enzymatische Biotinylierung durch die E. coli-Biotin-Proteinligase BirA ist sehr spezifisch und ermöglicht die Biotinylierung von Zielproteinen in ihrer heimischen Umgebung; Die aktuelle Verwendung der von BirA vermittelten Biotinylierung erfordert jedoch das Vorhandensein eines synthetischen Akzeptorpeptids (AP) im Zielprotein. Daher ist seine Anwendung auf Proteine beschränkt, die entwickelt wurden, um den AP zu enthalten. Der Zweck dieses Protokolls ist es, die bakterielle Darstellung eines Peptids aus einem unveränderten Zielprotein zu verwenden, um für BirA-Varianten auszuwählen, die das Peptid biotinylatieren. Das System basiert auf einem einzigen Plasmid, das die Koexpression von BirA-Varianten zusammen mit einem Gerüst für die Peptidanzeige auf der Bakterienoberfläche ermöglicht. Das Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Einbindung des Zielpeptids in das Displaygerüst, die Erstellung der BirA-Bibliothek, die Auswahl aktiver BirA-Varianten und die anfängliche Charakterisierung der isolierten BirA-Varianten. Das Verfahren bietet ein hochwirksames Selektionssystem zur Isolierung neuartiger BirA-Varianten, die für die weitergeleitete Weiterentwicklung von Biotin-Protein-Ligasen verwendet werden können, die ein natives Protein in komplexen Lösungen biotinylaten.

Introduction

Die Biotinylierung eines Proteins erzeugt ein leistungsstarkes Tag für seine Affinitätsisolierung und -detektion. Enzymatische Proteinbiotinylierung ist eine hochspezifische posttranslationale Modifikation, die durch Biotin-Protein-Ligasen katalysiert wird. Die E. coli Biotin-Protein-Ligase BirA ist extrem spezifisch und kovalent biotinylatiert nur eine begrenzte Anzahl natürlich vorkommender Proteine an spezifischen Lysinrückständen1. Die Vorteile der von BirA katalysierten Biotinylierung werden derzeit genutzt, indem das Zielprotein mit einem kleinen synthetischen 15-Aminosäure-Biotin-Akzeptid (AP) verschont wird, das effektiv biotinylatiert2 ist und die hochspezifische und effiziente In-vivo- und In-vitro-Biotinylierung durch Ko-Expression oder Zugabe von BirA3,4,5. Obwohl die in vivo und in vitro BirA katalysierte Biotin-Protein-Ligation eine attraktive Etikettierungsstrategie ist, beschränkt sich ihre Anwendung auf Proben, die AP-verschmolzene Proteine enthalten. Der Zweck dieser Methode ist die Entwicklung neuer Mutanten von Biotin-Protein-Ligasen, die selektiv native unveränderte Proteine biotinylaten und damit die Anzahl der Anwendungen erweitern, in denen die enzymatische Biotinylierungsstrategie eingesetzt werden kann.

Die Proteinfunktion kann durch iterative Runden der Genmutation, Selektion und Amplifikation von Genvarianten mit der gewünschten Funktion entwickelt werden. Eine starke und effiziente Selektionsstrategie ist entscheidend für die gezielte Evolution und die Biotin-Protein-Ligase-Aktivität ist aufgrund der starken Bindung zwischen Biotin und Streptavidin und seinen Homologen6leicht ausgewählt. Phage Display-Technologien ermöglichen die Auswahl von Phagen, die biotinylierte Peptide7,8zeigen. Da die Amplifikation isolierter Phagen eine Infektion eines bakteriellen Wirts erfordert, schafft die Phagenauswahl mit Streptavidin jedoch einen Engpass, da die hochaffine Bindung von Biotin an Streptavidin unter nicht-denaturierender Bedingungen. Um eine reversible Bindung von biotinylierten Phagen zu gewährleisten, wurden monomere Avidine mit geringerer Affinität verwendet, was zu einer bescheidenen Anreicherung von7. Wir haben vor kurzem eine bakterielle Anzeigemethode zur Isolierung neuartiger BirA-Varianten entwickelt, die die Notwendigkeit der Elution aus der Affinitätsmatrix eliminiert und damit einen Engpass aus früheren BirA-Selektionssystemen beseitigt9. Tatsächlich ermöglicht unser bakterielles Anzeigesystem eine >1.000.000-fache Anreicherung aktiver Klone in einem einzigen Selektionsschritt9und bietet so ein effektives Selektionssystem für die gezielte Weiterentwicklung neuartiger BirA-Varianten.

Unser bakterielles Anzeigesystem besteht aus zwei Komponenten, BirA mit einem C-Terminal 6xHis Tag und einem Gerüstprotein, das die Oberflächenanzeige eines Zielpeptids ermöglicht. Wir verwendeten das Gerüstprotein, das kreisförmig permutiertes äußeres Membranprotein X (eCPX) verstärkt hat, da die effektive Anzeige von Peptiden sowohl an den N- als auch an C-termini10,11beobachtet werden kann. Die Verschmelzung der Zielpeptidsequenz zum C-Terminus von eCPX gewährleistet die Biotinylierung von Bakterien, die aktive BirA-Varianten exdrücken. Die Bakterien ermöglichen die effektive Streptavidin-Auswahl, da das biotinylierte Peptid nun auf der Oberfläche angezeigt wird (Abbildung 1a).

Der Zweck dieser Methode ist es, für neuartige Varianten von BirA auszuwählen, die Peptidsequenzen in nativen Proteinen biotinylate. Das System wird durch Gene kodiert, die auf dem Plasmid pBAD-BirA-eCPX-AP vorhanden sind, das einen arabinose-induzierbaren Promotor enthält, der BirA (araBAD) kontrolliert, und einen T7-Promotor, der eCPX9 kontrolliert (Abbildung 1b). Das vorliegende Protokoll beschreibt das detaillierte Verfahren für die 1) Aufnahme eines Peptids aus einem Zielprotein in das C-Terminal von eCPX, 2) Die Erstellung einer Mutationsbibliothek von BirA durch fehleranfällige PCR, 3) Auswahl von Streptavidin-bindenden Bakterien durch magnetaktivierte Zellsortierung (MACS), 4) Quantifizierung der Bakterienanreicherung und 5) anfängliche Charakterisierung isolierter Klone.

Protocol

1. Einfügen der Peptid-Codierungssequenz in pBAD BirA-eCPX-AP HINWEIS: Um für BirA-Varianten auszuwählen, die ein natives Zielprotein biotinylaten, beginnen Sie mit der Identifizierung einer 15-Aminosäure-Peptidsequenz in der Primärsequenz der Proteine, die mindestens einen Lysin -Rückstand (K) enthält. Wechseln Sie zur Sequenzmanipulationssuite12. Fügen Sie die identifizierte 15 Aminosäure-Peptidsequenz in die Eingabebox im…

Representative Results

Westlicher Fleck von pBAD-BirA-eCPX-AP-exemitten Bakterien erzeugt ein 22 kDa-Streptavidin-reagierendes Band, das mit dem Molekulargewicht von eCPX übereinstimmt (Abbildung 2a). Im Gegensatz zu BirA-6xHis war biotinyliertee eCPX-AP sowohl in nicht induzierten als auch in induzierten Kulturen vorhanden(Abbildung 2a) aufgrund einer geringen T7-Promotoraktivität auch in nicht induzierten Kulturen und anschließender Biotinylierun…

Discussion

Wie bei allen Selektionsmethoden ist die Strenge der Waschschritte von größter Bedeutung. Da Bakterien vor der Verstärkung der ausgewählten Klone nicht aus den Perlen eluiert werden müssen, kann die hohe Affinitätsbindung zwischen Biotin und Streptavidin anstelle von avidinen mit geringerer Affinität, wie bisher mit dem Phagenanzeigesystem, für die Auswahl der BirA-Varianten7,8. Dadurch wird sichergestellt, dass seltene Klone ausgewählt werden und nicht …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Mohamed Abdullahi Ahmed für die kompetente Technikerhilfe. Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Lundbeck-Stiftung, der Novo Nordisk Foundation, der Danish Kidney Association, der Aase og Ejnar Danielsen Foundation, der A.P. M.Ller Foundation for the Advancement of Medical Science sowie Von Knud und Edith Eriksen unterstützt. Memorial Foundation.

Materials

10% precast polyacrylamide gel Bio-Rad 4561033
Ampicilin Sigma-Aldrich A1593
ApE – A plasmid editor v2.0 NA NA downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
Biotin Sigma-Aldrich B4501
DMSO Sigma-Aldrich D2650
DPBS (10X), no calcium, no magnesium ThermoFischer Scientific 14200083
DpnI restriction enzyme New England BioLabs R0176
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 ThermoFischer Scientific 65001
GenElute Plasmid Miniprep Kit Sigma-Aldrich PLN350
GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit Agilent Technologies 200552
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Immobilon-P PVDF Membrane Millipore IPVH15150
IPTG Sigma-Aldrich I6758
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NEB 5-alpha Competent E. coli New England BioLabs C2987
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFischer Scientific NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) ThermoFischer Scientific NP0009
pBAD-BirA-eCPX-AP Addgene 121907 Used a template and positive control
pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) Addgene 121908 negative control
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0491 For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
Skim Milk Powder Sigma-Aldrich 70166
Streptavidin-HRP Agilent Technologies P0397
T7 Express lysY/Iq Competent E. coli New England BioLabs C3013
Tryptone Millipore T9410
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
Western Lightning Plus-ECL PerkinElmer NEL103001EA
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625

References

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Cite This Article
Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes. J. Vis. Exp. (152), e60266, doi:10.3791/60266 (2019).

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