Dans cette étude, nous présentons des stratégies inhibitrices et siRNA-basées pour interférer avec le flux autophagique dans le virus simplex d’herpès type-1 (HSV-1)–infecté des cellules monocyte-dérivées de monocyte-dérivées.
Le virus de l’herpès simplex type-1 (HSV-1) induit l’autophagie dans les deux cellules dendritiques immatures (iDC) ainsi que dans les cellules dendritiques matures (MDC), tandis que le flux autophagique n’est observé que dans les iDC. Pour obtenir des connaissances mécanistes, nous avons développé des stratégies efficaces pour interférer avec le chiffre d’affaires autophagique induit par le HSV-1. Une stratégie basée sur l’inhibiteur, pour moduler l’autophagie induite par le HSV-1, constitue le premier choix, car il s’agit d’une méthode facile et rapide. Pour contourner les effets hors cible non spécifiques potentiels de tels composés, nous avons développé une stratégie alternative basée sur le siRNA, pour moduler le chiffre d’affaires autophagique dans les iDC s’ils étaient infectés par le VHS-1. En effet, l’électroporation des iDC avec l’ARNde FIP200-spécifique avant l’infection de HSV-1 est une méthode très spécifique et réussie pour aérer l’expression de protéine de FIP200 et ainsi pour inhiber le flux autophagique. Les deux méthodes présentées ont comme conséquence l’inhibition efficace du chiffre d’affaires autophagique HSV-1-induit dans iDCs, par lequel la technique siRNA-basée est plus spécifique de cible. Une approche siRNA-basée additionnelle a été développée pour réduire sélectivement au silence l’expression de protéine de KIF1B et de KIF2A, facilitant le chiffre d’affaires autophagique sur l’infection de HSV-1 dans les MDCs. En conclusion, la technique de l’électroporation de siRNA représente une stratégie prometteuse, pour aplanir sélectivement l’expression des protéines distinctes et pour analyser leur influence sur une infection de HSV-1.
La génération de cellules dendritiques d’origine monocyte humaine (DC) constitue un modèle in vitro approprié pour étudier les fonctions et la biologie de ce type important de cellules immunitaires. L’isolement ainsi que la différenciation des monocytes en DC s’est bien établi ces dernières années1,2. L’infection des DC avec l’herpès-herpès simplex virus de type 1 (HSV-1) sert de système modèle pour étudier les modulations HSV-1-négociées de la biologie DC2,3,4,5,6 . Ceci est particulièrement important pour élucider comment les herpèsvirus amortissent ou inhibent les réponses immunitaires antivirales puissantes, pour établir la latence dans les niches immunisées-privilégiées à l’intérieur de l’hôte7,8. À cet égard, les herpèsvirus sont des agents pathogènes très efficaces qui sont largement répandus dans toute la population atteignant une prévalence séro-jusqu’à 90 % selon la région géographique9. Pour comprendre et peut-être prévenir cela, plus d’informations sur les modulations HSV-1-négociées du système immunitaire de l’hôte, et en particulier des cellules immunitaires telles que les DC, sont nécessaires.
Une observation complètement nouvelle concernant l’interaction des DC avec HSV-1 a été récemment publiée par Turan et al.10. Les auteurs ont démontré que l’accomplissement de la réplication de HSV-1 dépend strictement du statut de maturation des DC. Dans les iDC, la réplication complète du HSV-1 est facilitée par des mécanismes dépendants de l’autophagie. Tandis que HSV1 induit l’autophagie dans les deux, iDCs et MDCs, flux autophagique est observé seulement dans iDCs. Ceci facilite à son tour l’évacuation nucléaire des capsides virales par la dégradation autophagique des lamins nucléaires dans les iDC. Pour obtenir des informations mécanistes sur cette voie de dégradation induite par le HSV-1 dans les cDI par rapport aux CDM, de nouvelles stratégies efficaces sont essentielles pour étudier le flux autophagique.
La macroautophagie (autophagie) est un procédé multi-étapes bien conservé ciblant les protéines intracellulaires ou les organites entiers pour la digestion lysosomal11. Simplistement, l’autophagie peut être divisée en (i) initiation, (ii) nucléation de membrane, (iii) expansion de vésicule, et (iv) phase de fusion autophagosome-lysosome12. Pendant l’initiation (i), des composants tels que le complexe activé ULK1/2 kinase, contenant la protéine d’interaction kinase focale d’adhérence de 200 kD (FIP200), sont essentiels pour activer le complexe beclin-1-Vps34-AMBRA1. Par la suite, la nucléation membranaire (ii) initie la formation de phagophore13, qui engloutit les cargaisons cytoplasmiques qui sont marquées par des molécules telles que p6214. Pendant l’expansion de vésicule et la maturation d’autophagophore (iii) microtubule-associé chaîne de lumière de protéine 3 (LC3)-I est converti en sa forme lipidique LC3-II qui est insérée dans la membrane autophagosomal. Ainsi, les taux de conversion LC3-I à -II sont un indicateur de l’induction de l’autophagie en reflétant la formation d’autophagosomes matures15,16. Lors de la fusion autophagosome-lysosome (iv), non seulement la cargaison autophagique, mais aussi les protéines associées p62 et LC3-II subissent une dégradation (par exemple, par hydrolyse). Ainsi, la perte de p62 et LC3-II servent de marqueurs pour le flux autophagique17. La fusion des autophagosomes avec des lysosomes, et donc suivant le chiffre d’affaires autophagique, est fortement dépendante de la localisation lysosomale intracellulaire. Ceci est, entre autres, réglementé par les membres de la famille kinesin KIF1B et KIF2A, qui ont été montrés pour affecter négativement autophagosome-lysosome fusion18. Fait intéressant, l’expression protéique de KIF1B et KIF2A est induite lors de la maturation DC et est donc responsable du flux autophagique inefficace dans les MDC infectés par le VhS-1, qui entrave la réplication complète du HSV-110.
Les tentatives expérimentales de moduler l’autophagie comprennent l’utilisation de composés connus pour induire ou inhiber cette voie particulière19,20,21. Dans cette étude, nous décrivons deux stratégies inhibitrices pour bloquer le chiffre d’affaires autophagique dans les iDC HSV-1-infectés. Le premier composé utilisé dans nos expériences est spécifique et puissant inhibiteur de l’autophagie-1 (spautin-1), qui a été décrit pour promouvoir la dégradation complexe beclin-1-Vps34-AMBRA1 au cours de la phase d’initiation de l’autophagie22. Le deuxième composé utilisé dans la présente étude est la bafilomycine-A1 (BA1), un inhibiteur de V-ATPase qui bloque les événements autophagiques tardifs (c.-à-d.la fusion autophagosome-lysosome aussi bien que l’acidification autolysosome)23,24. L’utilisation de l’un ou l’autre de ces deux inhibiteurs avant l’infection d’iDC avec HSV-1 inhibe potentiellement l’autophagie, mais ne perturbe pas l’expression efficace de gène viral. Ainsi, cette stratégie basée sur l’inhibiteur avant l’infection à HSV-1 offre un outil puissant pour inhiber le flux autophagique induit par le VhS-1 qui peut facilement être étendu pour une pléthore de différents types de cellules et de virus, qui induisent également potentiellement l’autophagie.
Pour surmonter un inconvénient majeur d’une approche basée sur les inhibiteurs (c.-à-d., des effets hors cible non spécifiques), nous avons développé une méthode basée sur le siRNA pour bloquer le flux autophagique dans les iDC (hSV-1-infectés). La technique de l’électroporation de siRNA représente une stratégie alternative puissante, par l’ablation sélective de l’expression des protéines distinctes (c.-à-d., composants autophagiques). Dans nos expériences, les iDC ont été électroporated avec l’ARNde FIP200-spécifique utilisant l’appareil d’électroporation I (voir tableau des matériaux) et un protocole modifié décrit par Gerer et autres (2017) et Prechtel et autres (2007), pour inhiber l’autophagie pendant le phase d’initiation25,26. Cette technique nous a permis de frapper spécifiquement l’expression FIP200 dans les iDC, sans interférer avec la viabilité cellulaire et leur phénotype immature deux jours après l’électroporation. Il convient de noter que l’infection au VHS-1 a été établie dans ces iDC électroporated reflétés par une expression efficace des protéines virales. Cette technique basée sur l’ARNre offre un avantage unique (c.-à-d., qu’une variété de différents composants autophagiques, même en combinaison), peut être spécifiquement ciblée pour l’ablation de leur expression.
Dans cette étude, nous décrivons en outre une méthode siRNA-basée pour induire le flux autophagique également dans HSV-1-infecté mDCs. Dans ce cas, les iDC ont été électroporated avec siRNA visé contre KIF1B et KIF2A avant la maturation de DC utilisant l’appareil d’électroporation II (voir tableau des matériaux). Puisque les deux protéines sont upregulated pendant la maturation de DC et connues pour réguler négativement la fusion des autophagosomes avec des lysosomes10,18, leur flux autophégique fortement induit de knockdown dans les MDCs sur l’infection de HSV-1. Ainsi, la technique basée sur le siRNA nous a permis d’induire spécifiquement le chiffre d’affaires autophagique en interférant avec l’expression de protéine de KIF dans les MDC, et pourrait ainsi imiter leurs niveaux d’expression dans les iDCs.
En résumé, nous présentons deux méthodes distinctes pour inhiber le flux autophagique dans les iDC HSV-1-infectés. Alors que la première approche basée sur l’inhibiteur constitue un moyen facile, bon marché et rapide d’interférer avec la dégradation autophagique, la deuxième technique basée sur le siRNA est plus spécifique et une méthode très appropriée pour soutenir et vérifier les résultats de l’inhibiteur à base Expériences. En outre, nous décrivons une méthode pour induire le flux autophagique également dans les MDC HSV-1-infectés, par l’intermédiaire du knockdown siRNA-négocié de deux protéines de KIF.
La portée du protocole actuel comprend (i) la manipulation des iDC humains dérivés de monocytes ainsi que des mDC, (ii) leur infection par le VHS-1, (iii) leur traitement avec des composés connus pour inhiber l’autophagie, et (iv) leur électroporation avec siRNA à l’aide de deux différentes configurations techniques. En utilisant le protocole actuel, le flux autophagique peut être bloqué dans les iDC infectés par le VhS-1 ou induit dans les MDC infectés par le VHS-1.
Puisque les DC, et en particulier les iDC, sont des cellules très vulnérables, travailler avec ces cellules implique des étapes plutôt délicates. Pour la génération DC, nous recommandons d’utiliser des PBMC fraîchement isolés, et d’éviter leur cryoconservation, afin d’obtenir des rendements cellulaires plus élevés. De plus, lors de la manipulation des iDC pendant les expériences, y compris leur culture ultérieure, prévenir les altérations de température sévères ou prolongées. Dans le cas contraire, les iDC pourraient subir des changements phénotypiques et il est donc nécessaire de vérifier leur phénotype immature par cytométrie de flux. Notez, contrairement à leurs homologues matures, iDC s’ils n’ont pas de marqueurs distincts, tels que CD80, CD83, et CD8628,29. L’infection des iDC et des MDC avec HSV-1 est une méthode bien établie2,3,4,5,6,10. Nous et d’autres avons montré que les CD sont très sensibles à l’infection par le VHS-1, lorsqu’un MOI de 1 ou 2 a été utilisé (figure 2). Dans nos mains, le maintien du volume du milieu de l’infection à de faibles niveaux (1-3 x 106 cellules dans 250-350 L) conduira à une meilleure efficacité de l’infection.
Une approche classique pour interférer avec une voie cellulaire distincte donnée est l’utilisation de composés spécifiques. Une variété de modulateurs différents de l’autophagie, c’est-à-d. activateurs ainsi que des inhibiteurs, sont actuellement disponibles30. En ce qui concerne hSV-1-induit autophagie dans DCs, Turan et al., (2019) a récemment montré les effets inhibiteurs de la spautin-1 et la bafilomycine-A1 (BA1) sur le chiffre d’affaires autophagique dans iDCs10. Cette technique pour l’inhibition de l’autophagie est appropriée pour la combinaison avec une infection ultérieure de HSV-1, puisque ni le taux d’infection ni le statut de maturation des DCs (particulièrement iDCs) n’est altéré. Dans les applications futures, cette approche basée sur l’inhibiteur pourrait être appliquée également en combinaison avec d’autres agents infectieux, les conditions de stress, telles que la famine, ainsi que pour différents types de cellules. Cependant, lors de l’utilisation d’inhibiteurs, des limitations se posent dans la détermination de la concentration appropriée pour une inhibition efficace de l’autophagie, sans affecter gravement la viabilité cellulaire. La principale limitation lors de l’utilisation d’inhibiteurs est, cependant, l’apparition d’effets indésirables potentiels hors cible ou indésirables, ce qui pourrait conduire à des résultats trompeurs31,32.
La deuxième approche pour interférer avec l’autophagie, couverte dans le protocole actuel, est le knockdown spécifique utilisant siRNA33,34,35. D’une part, nous avons utilisé l’appareil d’électroporation I pour acérer spécifiquement l’expression de FIP200, inhibant ainsi le roulement autophagique induit par HSV-1 dans les iDC. D’autre part, nous avons réduit au silence deux protéines KIF différentes (c.-à-d., KIF1B et KIF2A), en utilisant l’appareil d’électroporation II, pour faciliter le flux autophagique dans les MDC infectés par le VHS-1. Les deux protocoles d’électroporation ont donné lieu à une ablation presque complète de FIP200 dans les iDC, et de KIF1B/KIF2A dans les MDC, qui a été vérifiée par des analyses de taches occidentales(figure 4A, figure 5A). Contrairement à l’appareil d’électroporation I, qui n’affecte pas la viabilité des DC, l’électroporation des MDC à l’aide de l’appareil d’électroporation II entraîne des taux légèrement plus élevés de cellules mortes (Figure 4B, Figure 5B ). Par conséquent, dans les applications futures, l’appareil d’électroporation je devrais être utilisé de préférence pour les deux, iDCs et mDCs. Remarquablement, les deux techniques siRNA-basées, pour moduler le flux autophagique, sont compatibles avec l’infection suivante de HSV-1 des iDCs ou des MDC. En outre, ni le phénotype immature des iDCs ni le phénotype mûr des MDCs n’est altéré après électroporation.
L’électroporation des iDC utilisant l’ARNs fiP200-spécifique est une méthode efficace et très spécifique pour le knockdown de gène aussi bien que l’inhibition du flux autophagique sur l’infection de HSV-1. En plus du silence spécifique de FIP200, ce protocole peut être adapté pour faire taire d’autres composants autophagiques, participant à différentes étapes pendant la cascade autophagique. Cependant, l’identification de la cible appropriée pour l’inhibition efficace de l’autophagie par l’ARNar comprend plusieurs aspects préoccupants. Tout d’abord, l’efficacité de knockdown des gènes liés à l’autophagie (ATG) n’est pas nécessairement positivement corrélée avec l’inhibition efficace de l’autophagie et est fortement dépendante de la protéine spécifique ATG qui est réduite au silence36. Deuxièmement, les protéines ATG distinctes sont en outre impliqués dans des voies distinctes de l’autophagie, de ainsi leur ablation pourrait également conduire à des effets secondaires indésirables37,38,39. Troisièmement, différents ATG peuvent avoir des fonctions redondantes, de ce fait, le renversement d’un composant peut ne pas être suffisant pour inhiber l’autophagie(p. ex. ., beclin-1 et beclin-2)40.
En outre, l’appareil d’électroporation I-basé protocole d’électroporation des DCs est également approprié pour les ARNM, et pourrait être utilisé pour une variété de types de cellules primaires supplémentaires, tels que PBMCs25. Ce système fournit donc une stratégie générale pour livrer des espèces d’ARN distinctes dans différents types de cellules primaires. En conclusion, nous présentons deux protocoles pour inhiber le flux autophagique, en utilisant une approche inhibitrice ou siRNA-basée combinée avec l’infection suivante de HSV-1 des iDCs. En outre, nous décrivons une approche d’électroporation de siRNA pour induire le flux autophagique dans les MDCs sur l’infection de HSV-1.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le Conseil allemand de la recherche (DFG) par le biais du projet STE 432/11-1 attribué à AS et par le programme ELAN de la Faculté de Médecine (Friedrich-Alexander-Universitàt Erlangen-Nunberg) via le projet 18-12-21-1, accordé à LG.
4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | AAF-1002B | |
AB-Serum | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | H4522 | Dendritic cell cultivation |
ACD-A | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | 9007281 | |
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | V4XP-3024 | |
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare (Solingen, Germany) | RPN2232 | Western Blot Detection |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | A3678 | |
anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7076 | Western Blot detection |
anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7074 | Western Blot detection |
Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | tlrl-baf1 | inhibition of autophagy and lysosomal degradation |
BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 338962 | |
Benzonase | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | E1014 | |
Blotting Chamber Fastblot B44 | Biometra (Göttingen, Germany) | 846-015-100 | |
CCR7 (mouse, Pe-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 557648 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: G043H7 |
CD11c (mouse, Pe-Cy5) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 561692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: B-ly6 |
CD14 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555398 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: M5E2 |
CD3 (mouse, FITC) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555332 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: UCHT1 |
CD80 (mouse, V450) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 560442 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: L307.4 |
CD83 (mouse, APC) | eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 17-0839-41 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: HB15e |
CD86 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 553692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 |
EVOS FL Cell Imaging | System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA) | AMF4300 | |
FIP200 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 12436 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D10D11 |
GAPDH (mouse) | Merck Millipore (Massachusetts, USA) | AB2302 | Western Blot detection Dilution: 1:5000 Clone: MAB374 |
Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I) | BioRad Laboratories GmbH (München, Germany) | 165-2112 | |
GM-CSF (4×104 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-868 | |
HLA‐DR (mouse, APC-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 307618 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: L243 |
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 | BioVex | DC infection |
|
ICP0 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-53070 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 11060 |
ICP5 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-56989 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 3B6 |
IL-1β (0.1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1411-050 | |
IL-4 (1×106 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-924 | |
IL-6 (1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1404-050 | |
ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 28955810 | |
KIF1B (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-376246 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: E-12 |
KIF2A (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-271471 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D-7 |
LC3B (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 3868 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D11 |
L-glutamine | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-605E | |
LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit | Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) | L34964 | L/D staining in Flow cytometry |
Lymphoprep | Alere Technologies AS (Oslo, Norway) | 04-03-9391/01 | |
Magnesiumchloride | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A537.1 | |
Megafuge 2.0 RS | Heraeus (Hanau, Germany) | 75015505 | |
N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T9281 | |
Neubauer counting chamber | Brand (Wertheim, Germany) | 717805 | |
Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2) | Thermo Scientific (Rockford, USA) | 159910 | |
p62 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 88588 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D5L7G |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 26616 | |
Paraformaldehyde, 16 % | Alfa Aesar, Haverhill, USA | 43368.9M | |
PerfectSpin 24 Plus | Peqlab (Erlangen, Germany) | C2500-R-PL | |
PGE2 (1 mg/mL) | Pfizer (Berlin, Germany) | BE130681 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-512F | |
Protein gel system MiniProtean II | Bio-Rad Laboratories GmbH (München, Germany) | 1652960 | |
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific, Rockford, USA | 21059 | |
Rocking Platform wt 15 | Biometra (Göttingen, Germany) | 042-590 | |
RotiBlock | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A151.4 | |
Roti-Load 1 (4x) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | K929.3 | |
Rotiphorese Gel 30 (37.5:1) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 3029.1 | |
RPMI 1640 | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-167F | |
Sodium dodecyl Sulfate (SDS) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 2326.2 | |
Thermomixer comfort | Eppendorf (Hamburg, Germany) | 5355 000.011 | |
TNF-α (10 μg/mL) | Peprotech (Hamburg, Germany) | 300-01A | |
Tris | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 4855.3 | |
Trypan blue solution (0.4 %) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T8154 | |
Tween 20 | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 9127.1 | |
Whatman 0.2 μm nitrocellulose membrane | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 10600001 | |
WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr | Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany) | 3030917 |