Summary

Aislamiento de leucocitos de la leche materna humana para su uso en un ensayo de fagococitosis celular dependiente de anticuerpos de metas de VIH

Published: September 06, 2019
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Summary

La leche materna transmite el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), aunque sólo el 15 % de los lactantes amamantados por madres infectadas por el VIH se infectan. Los lactantes amamantados ingieres diariamente de 105x 108 leucocitos maternos, aunque estas células están poco estudiadas. Aquí describimos el aislamiento de los leucocitos de la leche materna y un análisis de su capacidad fagocítica.

Abstract

Incluso en ausencia de medicamentos antirretrovirales, sólo el 15 % de los lactantes amamantados por madres infectadas por el VIH se infectan, lo que sugiere un fuerte efecto protector de la leche materna (BM). A menos que el acceso al agua potable y a la leche maternizada adecuada para lactantes sea fiable, la OMS no recomienda el cese de la lactancia materna de las madres infectadas por el VIH. Numerosos factores probablemente funcionan en tándem para reducir la transmisión de BM. Los lactantes amamantados ingieres diariamente de 105x 108 leucocitos maternos, aunque lo que queda en gran medida poco claro es la contribución de estas células a las cualidades antivirales de BM. Actualmente teníamos como objetivo aislar las células de BM humano con el fin de medir fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), una de las respuestas inmunitarias innatas más esenciales y generalizadas, por los fagocitos BM contra los objetivos del VIH. Las células se aislaron a partir de 5 muestras de BM humanas obtenidas en varias etapas de la lactancia. El aislamiento se llevó a cabo a través de una centrifugación suave seguida de una cuidadosa eliminación de la grasa de la leche y el lavado repetido del pellet celular. Las perlas fluorescentes recubiertas con sobre vih (Env) se utilizaron como dianas para el análisis de ADCP. Las células se teñían con el marcador de superficie CD45 para identificar leucocitos. Se encontró que la actividad del ADCP era significativa por encima de los experimentos de control y reproducible utilizando un anticuerpo 830A específico para el VIH.

Introduction

La leche materna humana (BM) se compone de células maternas que son >90% viables1. La composición celular se ve fuertemente afectada por la etapa de la lactancia, el estado de salud de la madre y el bebé, y la variación individual, que sigue siendo mal entendido1,2,3,4. Dado que BM contiene 103x 105 leucocitos/ml, se puede estimar que los lactantes amamantados ingien de 105a 108 leucocitos maternos diariamente5. Varios estudios in vivo han demostrado que los leucocitosmaternos proporcionan inmunidad crítica al bebé y son funcionales mucho más allá de estos sitios de ingestión inicial5,6,7 ,9,10,11. Todas las células de origen materno ingeridas por el bebé tienen el potencial de realizar funciones inmunitarias junto a los leucocitos 12 o para compensar los propios leucocitos del bebé12.

La transmisión de madre a hijo (MTCT) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) sigue siendo una crisis en los países con recursos limitados. Dado que las enfermedades diarreicas y respiratorias son responsables de tasas sustanciales de mortalidad entre los lactantes en los países con recursos limitados, y estas enfermedades se reducen significativamente mediante la lactancia materna exclusiva, los beneficios para las madres infectadas por el VIH la lactancia materna supera con creces los riesgos13,14,15. A menos que el acceso al agua potable y a la leche adecuada para lactantes sea fiable, la OMS no recomienda el cese de la lactancia materna para las madres infectadas por el VIH16. Aproximadamente 100.000 MTCTs a través de BM ocurren anualmente; sin embargo, sólo el 15 % de los lactantes amamantados por sus madres infectadas por el VIH se infectan, lo que sugiere un fuerte efecto protector de BM17,18,19,20,21. Numerosos factores probablemente funcionan en conjunto para prevenir la transmisión. Es importante destacar que los anticuerpos específicos del VIH (Abs) en BM se han correlacionado con la reducción de la MTCT y/o la reducción de la muerte infantil por infección por VIH22,23. Lo que queda en gran medida poco claro es la contribución de la fracción celular de BM a sus cualidades antivirales.

Muchos Abs facilitan una variedad de actividades antivirales mediadas por la región “constante” de la molécula de inmunoglobulina, el fragmento cristalable (Fc), a través de la interacción con los receptores Fc (FCR) que se encuentran en prácticamente todas las células inmunitarias, prácticamente todas las cuales se encuentran en bm24humano. La fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) se ha demostrado como necesaria para el aclaramiento de infecciones virales y se ha estudiado en el caso de la prevención del MTCT del VIH25,26,27, 28 , 29. Dada la escasez de conocimientos sobre la posible contribución de la actividad de ADCP por parte de los fagocitos BM a la prevención del MTCT del VIH, nuestro objetivo era desarrollar un método riguroso para aislar las células de la BM humana con el fin de llevar a cabo un estudio de ADCP mediado por células de BM obtenido en varias etapas de la lactancia.

Protocol

Cada participante en este estudio fue reclutado y entrevistado de acuerdo con la aprobación de la junta de revisión ética e institucional (IRB) con la orientación y autorización del Programa para la Protección de Los Sujetos Humanos (PPHS) del Monte Sinaí utilizando un protocolo para la obtención de muestras de leche materna. 1. Preparación de la microesfera objetivo Seleccione un antígeno objetivo relevante.NOTA: En este ejemplo, se ut…

Representative Results

La leche se puede mantener a temperatura ambiente o más fría (aunque no congelada); sin embargo, dado que hemos observado una menor viabilidad cuando la leche se ha mantenido muy fría (los datos no se muestran), y que es más sencillo recoger, almacenar brevemente y transportar a temperatura ambiente, se recomienda que las muestras no se refrigeran para reducir variabilidad de muestra a muestra. En la leche obtenida 7-183 días después del parto, la concentración celular determinada …

Discussion

La técnica basada en citometría de flujo para medir la actividad de ADCP descrita en este documento se describió por primera vez en 201130 y desde entonces se ha demostrado robusta y citada en más de 80 estudios. El protocolo descrito aquí adapta esta técnica para su uso con células BM primarias por primera vez. Estudios previos de funcionalidad mediada por Fc por células BM se han limitado en gran medida a la medición de ráfagas oxidativas o ensayos de fagocitosis basados en histología…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a la Dra. Susan Zolla-Pazner en el Departamento de Medicina y departamento de microbiología de la Escuela de Medicina de Icahn en Mount Sinai por su revisión manuscrita. El NIH/NICHD proporcionó financiación para este proyecto con el número de subvención R21 HD095772-01A1. Además, R. Powell fue apoyado por fondos del Departamento de Medicina, División de Enfermedades Infecciosas, Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí.

Materials

1 µm FluoSpheres NeutrAvidin-Labeled Microspheres  Thermo Fisher F8776
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 BD 560975
Bovine serum Albumin MP Biomedicals 8810025
Corning V-bottom polystyrene 96-well plate  Corning  3894
Cytochalasin D Sigma 22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin kit  Thermo Fisher 21338
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352196
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Corning  352070
Fixable Viability Stain 450  BD 562247
Formaldehyde solution Sigma 252549 
HBSS without Calcium, Magnesium or Phenol Red Life Technologies 14175-095
Human BD Fc Block BD 564219
Human Serum Albumin MP Biomedicals 2191349
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional  34120
PBS 1x pH 7.4 Thermo Fisher 10010023
Polystyrene 10mL Serological Pipettes  Corning  4488
Protein Concentrators PES, 3K MWCO, 0.5 mL Pierce 88512

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Cite This Article
Powell, R. L., Fox, A. Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets. J. Vis. Exp. (151), e60149, doi:10.3791/60149 (2019).

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