نهج بسيط لاجراء قياسات TEER باستخدام الذاتي الصنع فولت-Amperemeter مع التردد القابل للبرمجة الناتج
Summary
هنا ، ونحن نظهر كيفيه اعداد غير مكلفه فولت-amperemeter مع تردد الإنتاج القابلة للبرمجة التي يمكن استخدامها مع الأقطاب الكهربائية عود المتاحة تجاريا لقياسات المقاومة الكهربية/البطانيات.
Abstract
وقد استخدمت المقاومة الكهربائية الغشائية/البطانية (TEER) منذ الثمانينات لتحديد كونفلوينسي ونفاذيه أنظمه نموذج الحاجز الأنبوبي. في معظم الحالات ، تستخدم أقطاب تشوستيك لتحديد المقاومة الكهربائية بين المقصورة العلوية والسفلية لنظام ادراج فلتر الخلية الذي يحتوي علي الطبقات الخلوية الاحاديه. يسمح غشاء الفلتر للخلايا بالتصاق والاستقطاب والتفاعل من خلال بناء تقاطعات ضيقه. وقد وصفت هذه التقنية مع مجموعه متنوعة من خطوط الخلايا المختلفة (علي سبيل المثال ، خلايا حاجز الدم في الدماغ ، حاجز الدم النخاعي السائل ، أو الجهاز الهضمي والمسالك الرئوية). يمكن الحصول علي أجهزه قياس TEER بسهوله من موردي المعدات المختبرية المختلفة. ومع ذلك ، هناك حلول أكثر فعاليه من حيث التكلفة وقابله للتخصيص يمكن تخيلها إذا كانت فولتاممتر المناسبة ذاتية التجميع. الهدف العام لهذا المنشور هو إنشاء جهاز موثوق به مع تردد الإخراج القابل للبرمجة والذي يمكن استخدامه مع أقطاب عود المتاحة تجاريا لقياس teer.
Introduction
تعمل الخلايا الظهاريه والبطانية كحدود خلوية ، تفصل بين الجانبين الابيكي والجانبي للجسم. إذا كانت متصلة من خلال تقاطعات ضيقه ، يتم تقييد انتشار المواد السلبية من خلال المساحات باراخليه1، مما ادي إلى تشكيل حاجز نفاذيه انتقائية. تم تطوير العديد من أنظمه الحاجز الاصطناعي2 باستخدام خلايا بطانية الاوعيه الدموية المجهرية (hbmec ، حاجز الدم في الدماغ3،4،5،6،7) ، الضفيرة المشيميه الخلايا الظهاريه (هيبكب/pcpec, الدم-السائل النخاعي الحاجز8,9,10,11,12,13,14), القولون والمستقيم الخلايا السرطانية (caco-2 ، والنماذج المعدية المعوية15) ، أو خطوط المسالك الهوائية/السنخيه (النماذج الرئوية16،17). وتتكون هذه النظم عاده من خلايا تزرع في طبقه أحاديه علي اغشيه قابله للاختراق (اي نظم ادراج الفلاتر) للسماح بالوصول إلى الجانبين الجانبي والرمزي. ومن المهم ان تتطابق سلامه النظام النموذجي مع الظروف المجرية. التالي ، تم تطوير العديد من التقنيات لتحليل وظيفة الحاجز عن طريق قياس الانتشار الخلوي لمركبات التتبع عبر طبقه الخلية. وتشمل هذه المواد السكروز شعاعي, صبغ المسمي الزلال, fitc المسمي انولين, أو صبغ المسمي الدكستران2. ومع ذلك ، الاصباغ الكيميائية يمكن ان تجعل الخلايا غير قابله للاستخدام لمزيد من التجارب. لمراقبه أنظمه الحاجز الارحال ، يمكن استخدام قياس المقاومة الكهربائية الخلوية/الغشائية عبر الطبقة الاحاديه الخلية2،18،19. ونظرا لان أنظمه القطب الثنائي القطب تتاثر بمقاومه الاستقطاب الكهربائي في الواجهة الكهربائية بالكهرباء ، تستخدم القياسات التيترابولاره عموما للتغلب علي هذا القيد20. تقنيه التشكلات هو الاستشعار أربعه محطه (4t) التي تم وصفها لأول مره في 1861 من قبل وليام طومسون (لورد كلفن)21. باختصار ، يتم حقن التيار من قبل زوج من الأقطاب الكهربائية الحالية في حين يتم استخدام زوج ثان من أقطاب استشعار الجهد لقياس انخفاض الجهد20. في الأيام الحاضرة ، ما يسمي أقطاب تشوستيك تتكون من زوج من أقطاب مزدوجة ، تحتوي كل منها علي بيليه الفضة/الفضة كلوريد لقياس الجهد والكهربائي الفضة لتمرير الحالي2. وتقاس المقاومة الكهربائية بين الحجيره والحجرة الاوليه مع طبقه الخلية بين (الشكل 1). ويتم تطبيق اشاره الموجه المربعة بتردد 12.5 هرتز عاده في الأقطاب الكهربية الخارجية ويتم قياس التيار المتناوب الناتج (AC). بالاضافه إلى ذلك ، يتم قياس الإسقاط المحتمل عبر طبقه الخلية بواسطة زوج القطب الكهربي الثاني (الداخلي). ثم يتم احتساب معاوقه الكهربائية وفقا لقانون أوم. يتم تطبيع قيم TEER عن طريق ضرب المقاومة ومنطقه سطح طبقه الخلية وعاده ما يتم التعبير عنها باسم Ω- سم2.
هناك أنظمه التي يتم ترتيب الخلايا والأقطاب الكهربائية بطريقه أكثر تطورا ، ولكن تستند أيضا علي مبدا قياس 4T ويمكن استخدامها مع نفس أجهزه القياس. أنظمه endohm ، علي سبيل المثال ، التي يتم ادراج عامل التصفية ، تحتوي علي غرفه وقبعة مع زوج من الأقطاب الكهربائية المتمركزة مع نفس بنيه القطب الكهربائي عود. شكل الأقطاب يسمح لتدفق الكثافة الحالية أكثر موحده عبر الغشاء ، التالي الحد من الاختلاف بين القراءات. حتى أكثر تعقيدا (ولكن أيضا أكثر دقه) هو غرفه Ussing ، حيث تفصل طبقه الخلية غرفتين مليئه بحل الرنين22. الغرفة نفسها يمكن ان تكون بالغاز مع الأكسجين ، CO2، أو N2، ويحركها أو تستكمل مع المواد التجريبية. كما يحدث النقل الأيوني عبر طبقه الخلية ، ويمكن قياس الفرق المحتملة من قبل اثنين من أقطاب الاستشعار عن بعد الجهد بالقرب من الانسجه. يتم إلغاء هذا الجهد من قبل اثنين من أقطاب تحمل الحالي وضعت بجانب طبقه الخلية. سيعطي ال يقاس تيار بعد ذلك الصافية أيون نقل والمقاومة [ترنسبيتليكل], اي يعكس حاجز نزاهة, يستطيع كنت حددت22. يمكن أيضا تطبيق قياس teer علي أنظمه الجسم علي رقاقه التي تمثل نماذج النسيج الحاجز23,24. هذه النظم تحاكي في ظروف الجسم العام للخلايا وغالبا ما تتكون من عده أنواع من الخلايا ، مكدسه فوق بعضها البعض في طبقات.
يشرح البروتوكول التالي كيفيه اعداد فولتاممتر فعاله من حيث التكلفة وموثوق بها مع تردد المخرجات القابلة للبرمجة التي لا تنتج اي فروق ذات دلاله احصائيه في TEER مقارنه بانظمه القياس المتاحة تجاريا.
Protocol
Representative Results
Discussion
قبل الذاتي–صنع فولتاممتر يمكن استخدامها في روتين يومي ، فمن الضروري للتحقق من الجهاز لوظيفة سليمه. في حالتنا ، تم برمجه نصف الوقت من التذبذب من 40 مللي ثانيه (12.5 هرتز) ، ولكن الوقت التذبذب الفعال تبين ان 60 مللي ثانيه (16.7 هرتز). لم يكن لهذا الدقة من باعث الوقت المتحكم الدقيق اي تاثير يمكن اكتشا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان ان يشكرا هيرمان ليغيماير ومارفن بن علي مشورتهما الفنية في التقنيات الكهربائية والمعلوماتية.
Materials
| 120 kOhm resistor | General (generic) equipment | ||
| Banana plug cables | General (generic) equipment | ||
| Cables | General (generic) equipment | ||
| Chopstick electrode | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Chopstick electrode (alternative) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Crimping tool | General tool | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Fetal calf serum (FCS)/Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Filter inserts 3µm translucent | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Insulation stripper | General tool | ||
| Luster terminal | General (generic) equipment | ||
| Oscilloscope | HAMEG | Digital Storage Scope HM 208 | |
| Plotter | PHILIPS | PM 8143 X-Y recorder | |
| Software Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Soldering iron | General tool | ||
| Soldering lugs | General (generic) equipment | ||
| Telephone cable with RJ14 (6P4C) connector | General (generic) equipment | ||
| Test resistor | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| True-RMS multimeters | VOLTCRAFT | VC185 | |
| USB charger | General (generic) equipment | ||
| USB extension cord | General (generic) equipment | ||
| Voltohmmeter for TEER measurement | WPI World Precision Instruments | EVOM | |
| Voltohmmeter for TEER measurement (alternative) | Merck Millicell | ERS | |
| Wire end ferrules | General (generic) equipment |
References
- Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
- Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2014).
- Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).
- Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).
- Ishiwata, I., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP). Human Cell. 18, 67-72 (2005).
- Dinner, S., et al. A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Schwerk, C., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PLoS One. 7, e30069 (2012).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).
- Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components. European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).
- Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes. Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).
- Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).
- Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).
- Mathia, N. R., et al. Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats. Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).
- Fuchs, S., et al. Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C. Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).
- Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Yeste, J., et al. Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures. Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754 (2016).
- Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. Methods of Measuring Electrical Resistance. , 100-131 (1912).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).
- Esch, M. B., et al. On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic ‘body-on-a-chip’ devices. Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).
- . Arduino Web Editor Available from: https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019)
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5 (2013).
- Hufnagl, M. . Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , (2010).
- Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R., Dössel, O., Schlegel, W. C. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. 25/7, (2009).
