Summary

Приемная иммунотерапия клеток iNKT в глюкозе-6-фосфатной исофазе (G6PI)-индуцированной РА мышей

Published: January 31, 2020
doi:

Summary

Этот протокол использует G6PI смешанные пептиды для построения ревматоидных моделей артрита, которые ближе к модели человеческого ревматоидного артрита в CD4и Т-клеток и цитокинов. Высокая чистота инвариантных естественных киллеров Т-клеток (главным образом iNKT2) со специфическими фенотипами и функциями были получены путем индукции in vivo и в пробирке для очищения для приемной иммунотерапии.

Abstract

Ревматоидный артрит (РА) является сложным хроническим воспалительным аутоиммунным заболеванием. Патогенез заболевания связан с инвариантными естественными клетками-убийцами Т (iNKT). Пациенты с активной РА представляют меньше iNKT клеток, дефектной функции клеток, и чрезмерная поляризация Th1. В этом исследовании, модель РА животных была создана с использованием смеси gpI325-339 и hGPI469-483 пептидов. Клетки iNKT были получены индукцией in vivo и очисткой in vitro, а затем настой в мышей РА для приемной иммунотерапии. Система обработки in vivo (IVIS) показала, что клетки iNKT в основном распределяются в селезенке и печени. На 12 день после клеточной терапии прогрессирование заболевания значительно замедлилось, клинические симптомы были смягчены, обилие клеток iNKT в тимусе увеличилось, доля iNKT1 в тимусе снизилась, а уровни ТНФ-З, IfN-Q и IL-6 в сыворотка уменьшилась. Приемная иммунотерапия клеток iNKT восстановила баланс иммунных клеток и исправила чрезмерное воспаление организма.

Introduction

Ревматоидный артрит (РА) является аутоиммунным заболеванием, характеризующимся хронической, прогрессирующей инвазивностью с частотой 0,5-1%1,2. Основной патогенез связан с аномальным распространением аутореактивныхCD4 иCD8 – Т-клеток, проявляющихся в увеличении доли CD4иIFN-Q иCD4– IL-17A Т-клеток, а также уменьшенного числа CD4ИЛ-4 и CD4 CD25FoxP3 Т-клеток. Поэтому секреция воспалительных цитокинов усиливается, а чрезмерная воспалительная реакция разрушает родной баланс и функцию толерантности иммунной системы организма. Кроме того, помощник Т-лимфоцитов (Т) 1 клетки, которые проникают в сустав, усугубляют воспалительные реакции и повреждения суставов. Таким образом, ингибирование чрезмерной воспалительной реакции и восстановление иммунной толерантности и иммунного баланса являются ключевыми для лечения РА3,4.

Ячейки iNKT имеют функции и характеристики НК-клеток и Т-клеток. Клетки iNKT питают различный, инвариантный Т-клеточный рецептор (TCR) – цепь с ограниченным репертуаром TCR и цепи5 и распознают гликолипидный антиген, представленный основным комплексом гистосовместимости (MHC) молекулы CD1d класса CD1d на поверхности антиген-представляя клеток. Mitsuo et al.6 обнаружили большое количество клеток iNKT и функциональные дефекты во многих аутоиммунных заболеваниях, включая РА. Aurore et al.7 продемонстрировали, что клетки iNKT оказывают положительное влияние на поддержание аутоиммунной толерантности и что при восстановлении количества и функции клеток iNKT болезнь облегчается. Кроме того, Miellot-Gafsou et al.8 обнаружили, что клетки iNKT не только анонсировали болезнь, но и увеличили прогрессирование заболевания. Эти противоречивые результаты свидетельствуют о том, что iNKT-клетки являются неоднородными Т-клетками, и функция различных подмножеств может быть обращена вспять. В клиническом исследовании РА частота клеток iNKT коррелирует со счетом активности заболевания9. Результаты также подтвердили, что частота iNKT была снижена у пациентов РА, количество CD4иIFN-я Т-клеток подмножества увеличились, и секреторные уровни воспалительных цитокинов IFN-я и TNF-я увеличилось10,11. Кроме того, Шариф и др.12 исследовали диабет типа 1 (T1D) и обнаружили, что селективный вливание клеток iNKT upregulated выражение воспалительного цитокина IL-4, поддерживаетиммунную толерантность, и предотвратить развитие диабета типа 1. Таким образом, приемная инфузия специфических клеток iNKT или целевая активация клеток iNKT повышает уровень клеток iNKT у пациентов РА, что может стать прорывом в лечении РА.

Клеточная иммунотерапия в настоящее время представляет большой интерес и широко используется в терапии рака. Тем не менее, iNKT клетки редки, неоднородные иммунорегуляторные клетки (только 0,3% от общего числа ПБМК)13, что ограничивает потенциальное клиническое применение. Эти клетки в основном делятся на три субпопуляции: 1) клетки iNKT1, которые имеют высокое выражение промиелоцитарного белка цинка-пальца (ПЛЗФ) и коэффициент акрипции Т-бокса (T-bet); 2) iNKT2 клетки с промежуточным выражением ПЛЗФ и связывающего белка GATA 3 (GATA3); 3) iNKT17 клетки с низкой экспрессией ПЛЗФ и ретиноидных связанных сирот ядерных рецепторов (ROR)-Зт, которые выделяют IFN-Я, IL-4, и IL-1714. Активированные клетки iNKT выделяют Th1, Th2 и Th17-подобные цитокины, которые определяют различные иммуномодулирующие эффекты клеток iNKT15. Иммуномодулирующие и иммунотерапевтические эффекты специфической активации различных субпопуляций клеток iNKT различны. Поэтому выбор специфических фенотипов клеток iNKT (главным образом iNKT2) с противовоспалительными функциями для регулирования иммунного ответа организма может исправить иммунный дисбаланс и иммунные расстройства в РА.

Создание идеальной модели животного имеет большое значение для лечения и изучения патогенеза РА. В настоящее время наиболее часто используемые и зрелые модели животных включают коллагена индуцированного артрита, адъювантного артрита, zymosan-индуцированного артрита, и полисахарид индуцированный артрит1617. Тем не менее, нет модели, которая может полностью имитировать все особенности человека РА. Тип II коллагена индуцированного артрита (ЦРУ) является классической моделью артрита. ЦРУ индуцируется иммунизации мышей с типом II коллагена конкретных моноклональных антител, отражающих зависимость антител этой модели заболевания. Бенус и др. описал модель с системным иммунным ответом на глюкозу-6-фосфат изомеразу (G6PI), которая вызывает периферический симметричный полиартрит в восприимчивых штаммов мыши18,19. В этой модели развитие артрита зависит от Т-клеток, В-клеток и врожденного иммунитета18,19,20. Horikoshi21 обнаружил, что модели РА в результате иммунизации мышей DBA/1 с фрагментами полипептида G6PI больше похожи на человеческие РА с точки зрения CD4и Т-клеток и цитокинов (т.е. IL-6 и TNF-я), чем модели ЦРУ. Для усиления стимулирующего эффекта на сайте распознавания TCR смешанные полипептидные фрагменты G6PI (hGPI325-339 и hGPI469-483) были использованы для иммунизации мышей DBA/1 для построения модели мыши РА. Уровень успеха этого подхода может быть высоким, потому что hGPI325-339 и hGPI469-483 являются иммунодоминирующими для I-A q-ограниченных Т-клеток ответов. Таким образом, эта модель может имитировать чрезмерное распространение CD4и Т-клеток и дефектов клеток iNKT у пациентов РА22. Фундаментальные исследования иммунопатологии РА заложили основу для нашего дальнейшего углубленного исследования.

Protocol

Все экспериментальные мыши (всего 150) были здоровыми мышами DBA/1, 6-8 недель (20,0 и 1,5 г), выращенных в специфической среде, свободной от патогенов (SPF). Существует нет специального лечения до моделирования. Эксперимент был разделен на здоровую контрольную группу (15 мышей), модельную контрольну…

Representative Results

Оценка индекса артрита и толщина лапы увеличились после моделирования. По сравнению с контрольной группой, на лицах группы моделей РА начал проявляться красный отек через 6 дней после моделирования, с постепенным обострением. В 14 дней, красный отек в голеностопном суставе достиг своего…

Discussion

iNKT-клетки представляют собой специальные Т-клетки, которые преодолевают врожденный и адаптивный иммунитет и в основном развиваются из CD4,CD8и тимоцитов. клетки iNKT обладают разнообразными иммунорегуляторными функциями и взаимодействуют с другими иммунными клетками путем пр…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Наше исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC) (81771755), колледжами и ключевым исследовательским проектом науки и техники университета провинции Хэбей (D2017009) и Центром медицинских экспериментов Animal Lab of Medical Experiment, Университетом Хэвэя. Мы благодарны за их поддержку.

Materials

Alexa Fluor 647 Mouse Anti-PLZF BD 563490 America
Anti-PE MicroBeads Miltenyi 130-048-801 Germany
Columns Miltenyi MS Germany
Cryogenic Centrifuge Beckman Allegra® X-15R America
DiR Thermo Fisher Scientific D12731 America
Embedding Center Tianjin Aviation Electromechanical Co., Ltd. BMJ-1 China
FITC Hamster Anti-Mouse TCR β Chain BD 553170 America
Flow cytometer BD Accuri C6 America
Freund's complete adjuvant Sigma F5881 America
hGPI325-339 (IWYINCFGCETHAML) Karebay Biochem 18062202 China
hGPI469-483 (EGNRPTNSIVFTKLT) Karebay Biochem 18062203 China
In Vivo Imaging System PerkinElmer caliper IVIS lumina II America
Ionomycin Calcium Cayman 10004974 America
KRN7000 AdipoGen AG-CN2-0013 America
Mouse CD1d Tetramer-PE MBL TS-MCD-1 Japan
Mouse percoll Solarbio P8620 China
Optical Microscope Olympus Olympus-II Japan
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-ROR-ϒt BD 562683 America
PerCP-CyTM5.5 Mouse anti-T-bet BD 561316 America
Pertussis toxin Sigma P7208 America
phorbol esters Cayman 10008014 America
Red Blood Cell Lysis Buffer BD 555899 America
RPMI-1640 Biological Industries 01-100-1ACS Israel
Th1/Th2/Th17 cytokines kit BD 560485 America
Ultramicrotome Leica Leica EM UC6 Germany

References

  1. Tobón, G. J., Youinou, P., Saraux, A. The environment, geo-epidemiology, and autoimmune disease: Rheumatoid arthritis. Autoimmunity Reviews. 35 (1), 0 (2010).
  2. Cross, M., et al. The global burden of rheumatoid arthritis: estimates from the Global Burden of Disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1316-1322 (2014).
  3. Kanashiro, A., Bassi, G. S., Queiróz Cunha, F. D., Ulloa, L. From neuroimunomodulation to bioelectronic treatment of rheumatoid arthritis. Bioelectronics in Medicine. 1 (2), 151-165 (2018).
  4. Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
  5. Bianca, B. S. Unraveling Natural Killer T-Cells Development. Frontiers in Immunology. 8, 1950 (2018).
  6. Mitsuo, A., et al. Decreased CD161+CD8+ T cells in the peripheral blood of patients suffering from rheumatic diseases. Rheumatology. 45 (12), 1477-1484 (2006).
  7. Miellot, A., et al. Activation of invariant NK T cells protects against experimental rheumatoid arthritis by an IL-10-dependent pathway. European Journal of Immunology. 35 (12), 3704-3713 (2005).
  8. Miellot-Gafsou, A., et al. Early activation of invariant natural killer T cells in a rheumatoid arthritis model and application to disease treatment. Immunology. 130 (2), 296-306 (2010).
  9. Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).
  10. Ming, M., et al. Effects on immunoregulation of iNKT cells in RA by novel synthetic immunostimulator CH1b. Chinese Journal of Immunology. 32 (02), 218-222 (2016).
  11. Ming, M., et al. Study of the correlation between the percentage of iNKT cells and the ratio of IFN-γ/IL-4 in patients with rheumatoid arthritis. Chinese Journal of Microbiology Immunology. 35 (3), 213-218 (2015).
  12. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by α-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nature Medicine. 7, 1057-1062 (2010).
  13. Gapin, L. Development of invariant natural killer T cells. Current Opinion in Immunology. 39, 68-74 (2016).
  14. Kwon, D. I., Lee, Y. J. Lineage Differentiation Program of Invariant Natural Killer T Cells. Immune Network. 17 (6), (2017).
  15. Thapa, P., et al. The differentiation of ROR-γt expressing iNKT17 cells is orchestrated by Runx1. Scientific Reports. 7 (1), 7018 (2017).
  16. Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focuson interferon-γ. Interferon Cytokine Research. 31 (12), 917-926 (2011).
  17. Van Haalen, H. G. M., Severens, J. L., Tran-Duy, A., Boonen, A. How cost-effectiveness A systematic review and stepwise approach for selecting a transferable health economic evaluation rheumatoid arthritis. Pharmacoeconomics. 32 (5), 429-442 (2014).
  18. Schubert, D., Maier, B., Morawietz, L., Krenn, V., Kamradt, T. Immunization with glucose-6-phosphate isomerase induces T cell-dependent peripheral polyarthritis in genetically unaltered mice. Journal of Immunology. 172, 4503-4509 (2004).
  19. Bockermann, R., Schubert, D., Kamradt, T., Holmdahl, R. Induction of a B-cell-dependent chronic arthritis with glucose-6-phosphate isomerase. Arthritis Research, Therapy. 7, 131613-131624 (2005).
  20. Kamradt, T., Schubert, D. The role and clinical implications of G6PI in experimental models of rheumatoid arthritis. Arthritis Research, Therapy. 7, 20-28 (2005).
  21. Horikoshi, M., et al. Activation of Invariant NKT Cells with Glycolipid Ligand α-Galactosylceramide Ameliorates Glucose-6-Phosphate Isomerase Peptide-Induced Arthritis. PlosOne. 7 (12), 51215 (2012).
  22. Zhang, X. J., et al. Immunization with mixed peptides derived from glucose-6-phosphate isomerase induces rheumatoid arthritis in DBA /1 mice. Chinese Journal of Pathophysiology. 32 (3), 569-576 (2016).
  23. Motohashi, S., Nakayama, T. Invariant natural killer T cell-based immunotherapy for cancer. Immunotherapy. 1 (1), 73 (2017).
  24. Jung, S., et al. The requirement of natural killer T-cells in tolerogenic APCs-mediated suppression of collagen-induced arthritis. Experimental and Molecular Medicine. 42 (8), 547-554 (2010).
  25. Luc, V. K., Lan, W. Therapeutic Potential of Invariant Natural Killer T Cells in Autoimmunity. Frontiers in Immunology. 9, 519-526 (2018).
  26. Chiba, A., et al. Suppression of collagen-induced arthritis by natural killer T cell activation with OCH, a sphingosine-truncated analog of α-galactosylceramide. Arthritis, Rheumatism. 50 (1), 305-313 (2004).
  27. Tudhope, S. J., Delwig, A. V., Falconer, J., Pratt, A., Ng, W. F. Profound invariant natural killer t-cell deficiency in inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 69 (10), 1873-1879 (2010).
  28. Bruns, L., et al. Immunization with an immunodominant self-peptide derived from glucose-6-phosphate isomerase induces arthritis in DBA/1 mice. Arthritis Research, Therapy. 11 (4), (2009).
  29. Parietti, V., et al. Rituximab treatment overcomes reduction of regulatory iNKT cells in patients with rheumatoid arthritis. Clinical Immunology. 134 (3), 331-339 (2010).
  30. Yoshida, Y., et al. Functional mechanism(s) of the inhibition of disease progression by combination treatment with fingolimod plus pathogenic antigen in a glucose-6-phosphate isomerase peptide-induced arthritis mouse model. Biological, Pharmaceutical Bulletin. 38 (8), 1120-1125 (2015).
  31. Chen, D., et al. Study of the adoptive immunotherapy on rheumatoid arthritis with Thymus-derived invariant natural killer T cells. International Immunopharmacology. 67, 427-440 (2019).

Play Video

Cite This Article
Meng, M., Chen, S., Gao, X., Liu, H., Wang, Y., Zhang, J., Dou, H., Li, W., Chen, D. Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice. J. Vis. Exp. (155), e60048, doi:10.3791/60048 (2020).

View Video