Summary

Обработка эмбриона, яичной скорлупы и грибковой культуры для сканирования электронной микроскопии

Published: August 16, 2019
doi:

Summary

Здесь мы представляем подробные протоколы обработки для визуализации деликатных образцов тканей с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Три различных метода обработки, а именно: hexamethyl disilazana (HMDS) химической сушки, простой сушки воздуха, и критической точки сушки описаны для подготовки жесткой яйцеклетки, эмбрионы на ранних стадиях развития, и грибковые культуры соответственно.

Abstract

Хотя сканирование электронной микроскопии (SEM) широко используется для ультра-структурного анализа различных биологических и небиологических образцов, методы, участвующие в обработке различных биологических образцов, включают в себя уникальные методы. Все обычные практики, описанные в литературе для обработки образцов, по-прежнему находят полезные применения, но незначительные изменения в подготовке образца могут изменить качество изображения, а также ввести артефакты. Таким образом, использование уникальной методики подготовки образца, специфичной для типа анализируемой ткани, необходимо для получения изображения хорошего качества с ультраструктурным разрешением. Основное внимание в этом исследовании заключается в обеспечении оптимальных протоколов подготовки образцов для визуализации эмбрионов, жесткой яичной скорлупы и грибковых культур с использованием SEM. Следующие оптимизации были рекомендованы для получения хороших результатов для трех различных деликатных биологических образцов, исследованных. Использование более мягких фиксаторов, таких как 4% параформальдегида или 3% глютаральдегида с последующим обезвоживанием с помощью этанола серии является обязательным. Грибковый мицелий на агарных блоках, полученных слайд-культурами, дает лучшую ультраструктурную целостность по сравнению с культурами, взятыми непосредственно из агарных пластин. Химическая сушка эмбрионов с помощью HMDS обеспечивает сушки без введения артефактов поверхностного натяжения по сравнению с критической точкой сушки. HMDS предотвращает растрескивание, вызванное усадкой, так как образцы менее хрупки во время сушки. Однако, для грибковой культуры, критической точки сушки обеспечивает приемлемое качество изображения по сравнению с химической сушки. Яичная скорлупа может быть изображена без каких-либо специальных шагов подготовки, за исключением тщательного мытья и сушки воздуха до монтажа. Методологии подготовки были стандартизированы на основе приемлемого качества изображения, полученного с каждым испытанием.

Introduction

Сканирующий электронный микроскоп (SEM) ультраструктурный анализ и внутриклеточные изображения дополняют световую микроскопию для трехмерного профилирования прокариот, растений и животных. Высокое пространственное разрешение SEM делает его одним из самых универсальных и мощных методов, доступных для изучения микроструктурных характеристик образцов на нанометре до микрометрового масштаба. Высохшие образцы решаются композиционных и топографических структур с интенсивной детализацией, что обеспечивает основу для разработки достоверных выводов о функциональных отношениях1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 (г. , 8 , 9. При интерпретации SEM изображения биологических образцов, это большая проблема, чтобы различать родные структуры и артефакты, которые создаются во время обработки. SEM, как правило, работает на очень высоком вакууме, чтобы избежать каких-либо помех от молекул газа, влияющих на первичные, вторичные или backscattered электронных лучей, испускаемых из образца10,11. Кроме того, биологические материалы подвержены радиационному повреждению из-за их неудовлетворительных или непроводящих свойств. Очень важно для образцов, загруженных в SEM, чтобы быть полностью сухим и свободным от каких-либо органических загрязняющих веществ, чтобы устранить любые возможные outgassing в условиях высокой вакуумной среды10,11. Поскольку биологические образцы в основном состоят из воды, необходимы дополнительные методы подготовки для обеспечения сохранения местных структур.

Полученное разрешение основано на оптимизации методов подготовки, характерных для используемых типов образцов и инструментальных параметров. Таким образом, необходимо избегать использования обобщенных шагов обработки для всех типов тканей. Некоторые биологические образцы потребуют менее строгой обработки, чтобы сохранить свою структуру, в то время как для деликатных типов образцов может потребоваться больше времени и заботы, чтобы избежать введения артефактов сушки, таких как усадка и коллапс. Подготовка образцов является важным шагом в визуализации SEM; результаты морфометрических исследований удивительно подвержены влиянию процедур подготовки образцов12,13. Общие шаги подготовки для многих биологических образцов фиксации, обезвоживания и покрытия с металлом, таких как золото, платина или палладий, чтобы преобразовать их поверхности, чтобы быть проводящих для анализа SEM. Характер и сочетание используемых шагов будет варьироваться в зависимости от типа ткани, и конкретные цели исследования. Наращивание заряда, чувствительность к повреждению вакуумного и электронного луча создают проблемы при обработке мягких нежных биологических образцов, что требует дополнительных этапов обработки для сохранения родной структуры объекта. Используя обычные методы, такие как фиксация тетроксида осмия и обезвоживание вызывают усадку и коллапс тонких тканей14,15,16,17. Целью исследования является создание элегантных методологий, полученных путем объединения идей из более ранних исследований с модификациями для подготовки и изображения мягких тонких тканей (например, эмбрионы рептилий, яичная скорлупа окрашенных черепах и грибковых культур).

Выбор подходящего метода фиксации является первым наиболее важным шагом для микроскопического анализа биологических образцов. Фиксация тканей сразу после изоляции от организма имеет важное значение для предотвращения изменения в их морфологии из-за разложения. Эффективный фиксатор должен прекратить клеточные процессы, быстро пронизывающие клетки и сохраняя эффект необратимо, чтобы стабилизировать структуру образца, чтобы выдержать как последующие шаги обработки, так и экспертизу в рамках SEM17 , 18. Хотя некоторые химические и физические методы фиксации известны, химическая фиксация чаще используется для биологических образцов, чтобы избежать каких-либо клеточных изменений из-за автолиза, гнилости и сушки эффектов. Существуют многочисленные фиксаторные химические формулировки, обсуждаемые в литературе17,19,20,21,22,23, фиксаторы, которые работают путем денатурирования и коагуляние биологических макромолекулов, и те, которые фиксируют ковалентно перекрестных связывания макромолекулы. Алкоголь используется в качестве денатурирующим фиксации, которые очень плохо сохраняют ультраструктуру и используются в основном для световой микроскопии и не рекомендуется для электронного микроскопического анализа. Перекрестные фиксаторы, такие как формальдегид, гюйтаральдегид и тетроксид осмия создают межмолекулярные и внутримолекулярные перекрестные связи между макромолекулами в тканях, обеспечивая превосходное сохранение ультраструктур11 ,24,25,26. Биологические образцы чувствительны к температуре. Температура в начале фиксации рекомендуется быть 4 градуса По Цельсию, чтобы уменьшить боковую подвижность мембранных белков, замедлить диффузию межклеточных молекул, а также замедлить скорость фиксации11. Время, необходимое для фиксации тканей во многом зависит от размера образца и скорости, с которой фиксатор рассеивается и реагирует с компонентами образца. Ночная фиксация в 4% параформальдегида или 3% глютаральдегида в PBS при 4 градусах по Цельсию является предпочтительным методом для АНАЛИЗА SEM образцов, используемых в данном исследовании для их последовательных проникающих свойств, которые позволяют более мелкие деликатные образцы, которые будут обработаны17 , 18 лет , 19 лет , 20 , 27. Пост-фиксация шаг с тетроксидом осмия устраняется не только из-за его токсического характера, но и найти для реализации не дополнительное преимущество для улучшения качества изображения для образцов, проанализированных в этом исследовании.

Биологические образцы содержат жидкости, которые мешают операции SEM; следовательно, образцы должны быть высушены, прежде чем вставлять его в камере образца SEM. После того, как обезвоживание обеспечивается, растворитель должен быть удален из ткани без создания артефактов в образцы из-за поверхностного натяжения / сушки. Три различных метода сушки были широко использованы при обработке тканей для SEM изображений: сушка воздуха, критической точки сушки, и заморозить сушки образцов28,29,30,31. Немногие изучения сообщают все 3 метода сушки производя идентичные результаты с образцами ткани животных28,29,30,31. Общая практика, используемая для небольших образцов химического обезвоживания, восходящей концентрации серии алкоголя и гексаметилдизилазан (HMDS), но более крупные образцы сушатсивается с помощью критической точки сушки (CPD) инструмент32. В процессе сушки значительные силы образуются в небольших полости, которые проходят через образец с помощью жидкого/газового интерфейса; это может даже привести к полному коллапсу полых структур33. Любая деформация, возникающая из-за лечения, может быть ошибочно принята как родная структурная особенность образца. Таким образом, обобщенный феномен обработки должен быть ликвидирован и уникальный процесс сушки должен быть стандартизирован для каждого типа ткани, особенно при анализе деликатных образцов ткани.

В нескольких исследованиях, проведенных с использованием различных комбинаций всех вышеупомянутых процессов, мы стандартизировали методы, которые могут быть использованы для SEM анализа трех тонких тканей: эмбрионов рептилий, яичной скорлупы окрашенных черепах и грибковых культур. Биологи и морфологи описывают нормальный и аномальный морфогенез во время развития эмбриона у репрезентативных позвоночных животных. Исследования по пути генной сигнализации зависят от морфологического описания новых структур. Чтобы избежать резких изменений в структуре эмбриона позвоночных во время анализа SEM, мы рекомендуем химическую сушку после обезвоживания. Химическая сушка с использованием HMDS является относительно новейшим методом сушки и преимущества включают относительную быстроту, простота использования, потери стоимости, а также ограниченный опыт и оборудование, необходимые9. CPD является широко используемой техникой сушки с использованием проходного CO2 через образцы при определенной температуре и давлении. Мы определили, что HMDS подходит для сушки мягких тонких тканей и позволяет более крупные образцы для обработки по сравнению с критической точки сушки, что вызвало обширную деформацию эмбриональных тканей. Несколько методов были использованы для подготовки образцов для SEM изображений для изучения морфологических характеристик грибов34. Грибковые образцы обычно фиксируются в тетроксид осмия следуют обезвоживание этанола и критической точки сушки, которые могут обеспечить удовлетворительные результаты, хотя токсическое воздействие тетроксида осмия6,7,35 и потеря грибковых материалов при изменении растворов во время обработки являются явными недостатками. Метод подготовки образца с использованием сушки воздуха без фиксации также практикуется36, но приводит к сморщенным и рухнувшим структурам, и наблюдение за такими образцами может быть легко неправильно истолковано при характеристике вида. Грибковые гифы теряет свою целостность в контакте с жидкостями и даже сушки не может быть достигнуто для восстановления структуры. Из-за этого эффекта, замораживание сушки обычно используется для сушки мягких тканей, как грибковый мицелий. Замораживание сушки хорошо работает для чистых материалов, но наличие каких-либо солей или секреции будет скрывать детали поверхности, которые будут определены только на стадии просмотра SEM. Мы соединили метод культуры слайдов с фиксацией гюмтараальдегида и критической точкой сушки, чтобы получить структурные детали нетронутых грибковых гифи и спор. Хотя сушка CPD вызвала усадку эмбрионов, она привела к хорошо сохранившимся мицелеевым структурам в сочетании с фиксацией глютаральдегида. Яичная скорлупа имеет первостепенное значение для эмбриона овипарных животных, не только действуя в качестве защитного покрытия, но и обеспечивая механическую стабильность, проницаемость газа и воды, а также запас кальция для развивающегося эмбриона. Пресноводные черепахи яичной скорлупы классифицируются как “жесткие” в зависимости от их структуры, и из-за их наличия получили значительное внимание от биологов1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 (г. , 37 , 38.

Мы подробно простые методы для легкого изучения яичной скорлупы и оболочки мембраны окрашены черепахи, которые могут быть применены к любой жесткой яичной скорлупы видов. Методологии подготовки оценивались на основе полученного качества изображения и сокращения потенциальных артефактов.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенные черепахи (Chrysemys picta) яйца, используемые в этом исследовании были собраны во время гнездования сезона мая по июнь 2015-16 от Райс-Крик полевой станции, Освего Нью-йорк с разрешения, полученного от Государственного департамента штата Нью-йорк по вопросам окружающе?…

Representative Results

На рисунке 1 показан сканирующий электронный микрографический анализ окрашенных эмбрионов черепах (Chrysemyspicta). Окрашенные яйца черепахи собраны и инкубированы на постельных принадлежностей среды, установленна на алюминиевых заглушках после химической сушки были ?…

Discussion

В нашем исследовании были протестированы различные агенты фиксации, методы обезвоживания и сушки для подготовки трех различных деликатных биологических образцов для визуализации SEM: эмбрионы, яичные скорлупы и грибковые культуры. SEM обычно используется для анализа поверхности, поэто?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Даниэля Балдассарре, SUNY Oswego за полезные обсуждения и комментарии к рукописи. Это исследование было поддержано Райс-Крик Associate Гранты, Освего; Вызов Гранты SUNY Oswego и Национальный научный фонд (NSF) Малые гранты для PGL и JG.

Materials

Agar Fischer Scientific S25127A for slide cultures
Aluminum pin stub Tedpella 16111 12.7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar BD 213400 DF0013-17-6 Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds
Chloramphenicol Fischer BioReagents BP904-100 Antibiotic for media
Coarse Vermiculite Greenhouse Megastore SO-VER-12 bedding medium
Clear 12- well plate Corning 07-201-589 for fixing embryo
Coverslips Fischer Scientific S17525B for slide culture
Critical Point Dryer Quorum CPD EMS850 critical point drying
Culture dishes Fischer Scientific 08 747B DISH PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol Fischer Scientific A406P 4 dehydration agent
Forceps- Aquarius Tweezers Tedpella 5804 style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm
Glutaraldehyde Fischer Scientific G151-1 fixative
Gold target for sputter coater DENTON VACUUM TAR001-0158 Gold Target, 2.375″ D X .002″
Hexamethyldisilazana Fischer Scientific C19479-5000 chemical drying agent
Kim wipes Kimtech S-8115 cleaning
Microscope slides Thermo Scientific 67-762-16 for slide culture
Microscopy Scissors Tedpella 1327 Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8").
Micro-scissors Tedpella 1346 Vannas-type, straight, 80mm L
Moria Perforated Embryo Spoon Fine Science Tools 10370-17 Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm
Netwell Inserts Corning 0330B09 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents
Paraformaldehyde Fischer Scientific T353 500 fixative
Peat moss Walmart- Miracle Gro 551705263 bedding medium
PELCO tabs double stick carbon conductive tape Tedpella 5000 12 mm OD
Sputter coater DENTON VACUUM DESK V thin metal coating
SEM JEOL USA JEOL JSM 6610LV scanning electron scope electron microscopy

References

  1. Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
  2. Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
  3. Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
  4. Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
  5. Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
  6. Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
  7. Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
  8. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  9. Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
  10. Echlin, P. . Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , (2009).
  11. Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
  12. Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
  13. Baker, J. R. . Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , (1958).
  14. Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
  15. Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , 13-105 (1970).
  16. Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
  17. Hayat, M. A. . Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , (2000).
  18. Hayat, M. A. . Fixation for electron microscopy. , (1981).
  19. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  20. McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405 (1976).
  21. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  22. Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
  23. Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
  24. Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
  25. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
  26. Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
  27. Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
  28. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  29. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
  30. Barre, C., O’Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
  31. Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
  32. Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
  33. Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
  34. Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
  35. Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
  36. Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
  37. Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
  38. Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
  39. Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
  40. Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
  41. Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
  42. Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
  43. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
  44. Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate “Gymnodinioid” Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
  45. Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
  46. Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
  47. Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
  48. Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
  49. Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, (1990).
  50. Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
  51. Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
  52. Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).

Play Video

Cite This Article
Gibbons, J., Geetha-Loganathan, P. Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (150), e60018, doi:10.3791/60018 (2019).

View Video