Generazione ad alta efficienza di cellule T Topo primario specifico dell'antigene per test funzionali in un modello di diabete autoimmune
Summary
Questo articolo descrive un protocollo per la generazione di cellule T CD8 specifiche dell’antigene e la loro espansione in vitro, con l’obiettivo di produrre un numero elevato di cellule T funzionali da utilizzare in vitro e in vivo.
Abstract
Il diabete di tipo 1 (T1D) è caratterizzato da un’autoimmunità specifica dell’iletto che porta alla distruzione delle cellule beta e alla perdita assoluta della produzione di insulina. Nel modello di topo spontaneo del diabete non obesi (NOD), l’insulina è l’obiettivo primario e la manipolazione genetica di questi animali per rimuovere un singolo epitopo insulinico chiave previene la malattia. Pertanto, l’eliminazione selettiva delle cellule professionali che presentano antigeni (APC) recanti questo epitopo patogeno è un approccio per inibire le risposte autoimmuni indesiderate specifiche dell’insulina e probabilmente ha un maggiore potenziale traslazionale.
I recettori degli antigeni chimerici (CR) possono reindirizzare le cellule T a colpire selettivamente gli antigeni che causano la malattia. Questa tecnica è fondamentale per i recenti tentativi di utilizzare l’ingegneria cellulare per la terapia cellulare adottiva per il trattamento di tumori multipli. In questo protocollo, descriviamo un retrovirus a cellule T ottimizzato (RV) e un protocollo di espansione in vitro che genera un numero elevato di cellule CD8 CAR-T specifiche dell’antigene funzionale a partire da un basso numero di cellule ingenue. In precedenza sono stati descritti più protocolli cellulari CAR-T, ma in genere con efficienza di trasduzione relativamente bassa e vitalità cellulare dopo la trasduzione. Al contrario, il nostro protocollo fornisce fino al 90% di efficienza di trasduzione e le cellule generate possono sopravvivere più di due settimane in vivo e ritardare significativamente l’insorgenza della malattia a seguito di una singola infusione. Forniamo una descrizione dettagliata del protocollo di manutenzione e trasduzione delle cellule, in modo che i passaggi critici possano essere facilmente seguiti. L’intera procedura dall’isolamento cellulare primario all’espressione CAR può essere eseguita entro 14 giorni. Il metodo generale può essere applicato a qualsiasi modello di malattia del topo in cui l’obiettivo è noto. Allo stesso modo, l’applicazione specifica (mirata a un complesso patogeno di peptidi/Classe MHC II) è applicabile a qualsiasi altro modello di malattia autoimmune per il quale è stato identificato un complesso chiave.
Introduction
Dato il probabile rischio ridotto di effetti off-target indesiderati, le terapie immunitarie specifiche dell’antigene (ASI) sono trattamenti promettenti per malattie autoimmuni come il T1D. Sempre più prove suggeriscono che le risposte immunitarie all’insulina (prepro)possono essere particolarmente importanti nel T1D1. Nell’ultimo decennio, studi condotti da più gruppi, incluso il nostro, suggeriscono fortemente che la presentazione di un epitopo contenente aminoacidi della catena di insulina B da 9 a 23 da specifiche molecole MHC di classe II (B:9-23/MHCII), svolge un ruolo importante nello sviluppo del T1D in topi e esseri umani2,3,4,5. Per indirizzare selettivamente il complesso B:9-23/MHCII, abbiamo generato un anticorpo monoclonale, chiamato mAb287, che non ha alcuna reattività incrociata all’ormone insulina o complessi contenenti altri peptidi6. MAb287 blocca la presentazione dell’antigene in vitro, e la somministrazione settimanale di mAb287 ai topi NOD pre-diabetici ha ritardato lo sviluppo di T1D nel 35% dei topi trattati6. Per bloccare la presentazione dell’antigene in vivo, sono in genere necessarie iniezioni frequenti per mantenere un’alta concentrazione circolante. Abbiamo ipotizzato che avremmo potuto superare questa difficoltà sfruttando l’alta specificità di Ab287 per riprogrammare le cellule T, fornendo così una migliore terapia con cellule T specifico dell’antigene per T1D7.
Le cellule T citotossiche sono segnalate per essere in grado di uccidere il loro bersaglio se anche una singola copia del loro ligando cognato è espresso8,9,10. Pertanto, si prevede che le cellule T CD8 specifiche di B:9-23/MHCII avranno una maggiore efficienza nell’eliminare la presentazione indesiderata dell’antigene rispetto all’anticorpo genitore, che probabilmente dovrà essere associato a più complessi sullo stesso APC per esercitarne l’effetto. Cellule CAR T sono state utilizzate per il trattamento di più tumori umani11,12,13, e può anche essere efficace in autoimmunità14. Tuttavia, le cellule CAR-T con specificità per i complessi patogeni di peptidi-MHC non sono state finora utilizzate per modificare la progressione del T1D. Utilizzando la tecnica ottimizzata di trasduzione delle cellule T CD8 descritta di seguito, abbiamo recentemente dimostrato la prova di principio che questo rappresenta effettivamente un approccio praticabile7.
In questo protocollo, illustreremo un metodo di trasduzione ed espansione efficiente e semplificato. Il nostro protocollo è applicabile ad altri studi che richiedono la generazione di cellule T CD8 CD8 per topi con alta efficienza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo efficiente per produrre cellule CD8 CAR-T specifiche dell’antigene mediante trasduzione retrovirale. L’efficienza di trasduzione del nostro protocollo è tipicamente elevata, e si osserva generalmente un’espressione robusta della RCA. Le cellule CAR T espanse mantengono le caratteristiche essenziali delle cellule T attivate dai genitori e la specificità degli anticorpi e sono adatte sia per l’uso in vitro che in vivo. Abbiamo applicato cellule T Ab-CAR CD8 nella riprogrammazione del …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da JDRF sovvenzioni 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B, e SRA-2-S-2018-648-S-B, un diabete istruzione e azione Award, e il Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine presso Baylor College of Medicine. Lo smistamento delle cellule è stato supportato dal Cytometry and Cell Sorting Core del Baylor College of Medicine con il finanziamento del NIH (S10RR024574 e P30CA125123). Tutti i tetrameri peptide-MHC sono stati ottenuti dal NIH Tetramer Core Facility.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 uM |
| 5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
| anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
| Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
| Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
| Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
| rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
| rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
References
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 Diabetes. Lancet. 383, 69-82 (2014).
- Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality. Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).
- Nakayama, M., et al. Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice. Nature. 435, 220-223 (2005).
- Crawford, F., et al. Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).
- Stadinski, B. D., et al. Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).
- Zhang, L., et al. Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).
- Zhang, L., et al. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).
- Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 3, 973-983 (2003).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419, 845-849 (2002).
- Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
- Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells. Blood. 116, 3875-3886 (2010).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).
- Fishman, S., et al. Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes. Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).
- Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).
- Johnstone, A., Thorpe, R. . Immunochemistry in practice. , (1996).
- Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. . Lymphocytes: a practical approach. , (2000).
- Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).
- Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons. Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).
- Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse. PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).
- Jansen, A., et al. Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice. Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).
- Corbett, A. J., et al. T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways. Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).
- Griffith, I. J., et al. Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).
- Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).
- Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection. Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).
