Multiplex fluorescente imunoistoquímica é uma tecnologia emergente que permite a visualização de vários tipos de células dentro de formalina intacta-fixo, parafina incorporado (FFPE) tecido. Apresentados são diretrizes para garantir um multiplex de 7 cores bem sucedido com instruções para otimizar anticorpos e reagentes, preparando slides, design e dicas para evitar problemas comuns.
A avaliação do microambiente do tecido intacto para análise da infiltração celular e da organização espacial é essencial para a compreensão da complexidade dos processos da doença. As técnicas do princípio usadas no passado incluem immunohistochemistry (IHC) e imunofluorescência (se) que permitem o visualização das pilhas como um instantâneo a tempo usando entre 1 e 4 marcadores. Ambas as técnicas têm deficiências, incluindo dificuldade em manchar alvos pouco antigênicos e limitações relacionadas à reatividade entre espécies. IHC é confiável e reprodutível, mas a natureza da química e dependência do espectro de luz visível permite que apenas alguns marcadores para ser usado e faz colocalização desafiador. O uso de IF amplia os marcadores potenciais, mas tipicamente depende do tecido congelado devido à extensa autofluorescência tecidual após fixação de formalina. A citometria de fluxo, uma técnica que permite a rotulagem simultânea de múltiplos Epitopes, AB roga muitas das deficiências de If e de IHC, entretanto, a necessidade de examinar pilhas como uma única suspensão da pilha perde o contexto espacial das pilhas que descartam importante biológico Relações. Multiplex fluorescente imunoistoquímica (mfIHC) pontes estas tecnologias permitindo multi-epitope fenotipagem celular em formalina fixa parafina incorporado (FFPE) tecido, preservando a arquitetura global do microambiente e espacial relação de células dentro do tecido intacto ininterrompido. Os fluoróforos fluorescentes elevados da intensidade que lig covalentemente ao epítopo mapeado do tecido permitem aplicações múltiplas de anticorpos preliminares sem preocupação da Cruz-reactividade específica da espécie por anticorpos secundários. Embora esta tecnologia tenha sido comprovada para produzir imagens confiáveis e precisas para o estudo da doença, o processo de criação de uma estratégia de coloração útil mfIHC pode ser demorado e exigente devido à extensa otimização e design. Para fazer imagens robustas que representem interações celulares precisas in situ e para mitigar o período de otimização para a análise manual, apresentamos aqui métodos para preparação de slides, otimização de anticorpos, design multiplex, bem como erros comumente encontrados durante o processo de coloração.
O visualização de um microambiente intacto do tumor (TME) é essencial em avaliar não somente a infiltração celular em malignidades contínuas mas a pilha às interações da pilha também. O multiplex fluorescente immunohistochemistry (mfihc) emergiu como uma ferramenta eficaz para o fenotipagem do multi-antígeno das pilhas no estudo do cancro e das doenças associadas1,2,3,4, 5,6,7. Isso, em combinação com novos softwares e programas projetados para analisar grandes conjuntos de dados, possibilita a observação de interações complexas entre as células1,2,4. O fator limitante da taxa na aquisição de dados é muitas vezes a qualidade do tecido manchado antes da análise.
As técnicas precedentes usadas às pilhas do phenotype no TME incluem immunohistochemistry (IHC), imunofluorescência (se) e citometria do fluxo todos que apresentam limitações significativas. IHC usa a parafina fixa do formalina encaixou seções do tecido (FFPE) que são desparaffinized e rehidratado antes de ser manchada por a maioria frequentemente de um anticorpo. O uso de um anticorpo secundário encadernado de peroxidase de rábano (HRP) e uma reação química permite a visualização de um único epítopo antigênico8. Quando IHC for de confiança e executado no tecido de FFPE que é fácil de trabalhar com, as limitações ao espectro claro visível significam que somente um ou dois marcadores podem ser ilustres de confiança e colocalization dos antígenos completamente difíceis8. Uma maneira de expandir os marcadores disponíveis e, portanto, antígenos que podem ser sonados em uma única seção é mudar para a fluorescência que permite o uso de uma gama mais ampla do espectro visual. Para se, o tecido congelado ou de FFPE é transferido nas corrediças e nos anticorpos usados que são conjugados aos vários Fluorophores. Enquanto isso aumenta o número de antígenos que podem ser sonados, existem várias limitações importantes. Primeiramente, porque cada anticorpo tem tipicamente somente um fluoróforo Unido, o brilho é frequentemente não forte bastante superar o autofluorescence do tecido. É por esta razão, a maioria se é realizada em tecido congelado que é caro para armazenar e difícil de trabalhar. Um número limitado de etiquetas fluorescentes está disponível para o uso devido à sobreposição espectral e à reactividade transversal da espécie particularmente quando os anticorpos non-conjugated são usados. A citometria de fluxo, que consiste em processamento de tecido fresco em uma única suspensão celular e rotulagem com anticorpos fluorescentes tem sido o padrão-ouro para imunofenotipagem por décadas9,10. Um benefício da citometria de fluxo é a capacidade de rotular múltiplos anticorpos sem preocupação com a reatividade cruzada das espécies, pois a maioria é conjugada. Porque as células são “visualizadas” por uma máquina e não olhos humanos, há muito mais fluoróforos disponíveis, mas isso vem com um custo. A compensação deve ser feita manualmente, o que pode alterar significativamente os resultados produzindo falsas populações positivas e negativas. A limitação a mais significativa da citometria do fluxo é que a arquitetura do tecido e subseqüentemente toda a informação espacial é perdida pela necessidade para a única suspensão das pilhas.
Immunohistochemistry fluorescente Multiplex (mfihc) usando um microscópio fluorescente automatizado em combinação com o software novo combina os benefícios de IHC, de se e de citometria do fluxo permitindo o tecido do multi-antígeno que mancha com amplificação do sinal e retenção de relacionamentos espaciais sem a necessidade de compensação. O tecido de FFPE é coloc em corrediças carregadas que, após a recuperação do antígeno, submete-se a uma rodada da aplicação preliminar do anticorpo ao antígeno do alvo do interesse seguido por um anticorpo secundário com um tag químico de HRP, similar ao IHC. Após a colocação do anticorpo secundário, uma reação específica de HRP conduz a uma ligação covalentemente do fluoróforo ao epítopo de interesse11. Uma vez que o tecido é rotulado, outra rodada de aquecimento das lâminas é concluída removendo o complexo de anticorpos primários e secundários previamente aplicados deixando apenas a marca fluorescente ligada ao epítopo do tecido11. Isso permite que múltiplos anticorpos de qualquer espécie sejam reaplicados sem preocupação com a reatividade cruzada11,12. Para minimizar toda a necessidade para a compensação manual de tinturas fluorescentes múltiplas, uma coleção dos fluoróforos com pouca sobreposição espectral que inclui uma mancha contrária nuclear é usada para terminar o mfihc. Para dar conta da autofluorescência encontrada com o tecido FFPE, o software subtrai a autofluorescência da imagem final usando uma imagem de um slide em branco que é possível devido à resistência da fluorescência específica do antígeno após fluoróforo amplificação do sinal. Usando novos programas projetados para grandes conjuntos de dados, os locais das células podem ser identificados e analisados para o contexto espacial1,2,4. A limitação mais significativa dessa técnica é o tempo de otimização. Uma metodologia detalhada com instruções para o projeto experimental e A coloração e a estratégia da imagem latente são encontradas aqui. o mfIHC será útil para laboratórios que atualmente não possuem um sistema de coloração automatizado otimizado que gostaria de entender melhor o contexto espacial das interações célula a célula no tecido de FFPE intacto usando a técnica manual.
Os espécimes intactos do tecido da biópsia contínua do tumor e do resection cirúrgico permanecem ferramentas diagnósticas e preditivas importantes para a análise da doença assim como o prognóstico paciente. Multiplex fluorescente immunohistochemistry (mfIHC) é uma técnica nova que combine os benefícios do immunohistochemistry (IHC), da imunofluorescência (se) e do fluxo cytometry. Métodos prévios para sondar as células in situ permitiram a avaliação de arranjos célula a célula em um ambiente tecidual<s…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Ed Stack, anteriormente de Perkin Elmer, por sua assistência com a configuração e otimização da coloração multiplex original. Os autores também gostariam de agradecer a Kristen Schmidt de Akoya Biosciences por dicas usando o software de análise. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelos institutos nacionais de câncer de saúde o prêmio número P30CA046592, K08CA201581 (Tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (MPM), RSG1417301CSM (MPM), R01CA19807403 (MPM), U01CA22414501 (MPM, HC), CA170568 (HC). O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde. Apoio adicional foi fornecido por Jeffery A. Colby Colon Cancer e Tom Liu Memorial Research fundos.
100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
Hybridization oven | FisherBiotech | ||
Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
Xylene | Fisher | X3P1GAL |