Rilevamento oncogenico della fusione genica utilizzando la reazione della catena di polimerasi multiplex ancorata seguita dal sequenziamento di nuova generazione
Summary
Questo articolo descrive in dettaglio l’uso di un kit di preparazione della libreria a catena di reazione a catena multiplea Vengono descritte entrambe le fasi di analisi wet-bench e dei dati.
Abstract
Le fusioni geniche spesso contribuiscono al fenotipo oncogenico di molti tipi diversi di cancro. Inoltre, la presenza di alcune fusioni in campioni di pazienti oncologici spesso influenza direttamente la diagnosi, la prognosi e/o la selezione della terapia. Di conseguenza, l’accurata rilevazione delle fusioni geniche è diventata una componente critica della gestione clinica per molti tipi di malattie. Fino a poco tempo fa, la rilevazione clinica della fusione genica era effettuata prevalentemente attraverso l’uso di saggi unigene. Tuttavia, l’elenco in continua crescita delle fusioni geniche con significato clinico ha creato la necessità di valutare contemporaneamente lo stato di fusione di più geni. I test basati sul sequenziamento di nuova generazione (NGS) hanno soddisfatto questa domanda attraverso la capacità di sequenziare l’acido nucleico in modo massicciamente parallelo. Sono ora disponibili per l’uso nella diagnostica molecolare clinica, ognuno con i propri punti di forza e di debolezza, che utilizzano diverse strategie per l’arricchimento dei bersagli genici. Questo articolo descrive l’uso dell’arricchimento del bersaglio e della preparazione della biblioteca basati su PCR (AMP) ancorato seguito da NGS per valutare le fusioni geniche nei campioni clinici del tumore solido. AMP è unico tra gli approcci di arricchimento basati sull’amplicon in quanto identifica le fusioni geniche indipendentemente dall’identità del partner di fusione. Di seguito sono riportate sia le fasi di analisi della panca umida che quelli che garantiscono un rilevamento accurato della fusione genica da campioni clinici.
Introduction
La fusione di due o più geni in una singola entità trascrizionale può avvenire come risultato di variazioni cromosomiche su larga scala, tra cui delezioni, duplicazioni, inserimenti, inversioni e traslocazioni. Attraverso il controllo trascrizionale alterato e/o le proprietà funzionali alterate del prodotto genetico espresso, questi geni di fusione possono conferire proprietà oncogene alle cellule tumorali1. In molti casi, i geni di fusione sono noti per agire come driver oncogeni primari attivando direttamente la proliferazione cellulare e le vie di sopravvivenza.
La rilevanza clinica delle fusioni geniche per i pazienti oncologici è diventata evidente con la scoperta del cromosoma di Filadelfia e del corrispondente gene di fusione BCR-ABL1 nella leucemia mielogiosa cronica (CML)2. L’imasilatere di piccole molecole imalistio mesylate è stato sviluppato per indirizzare specificamente questo gene di fusione e ha dimostrato una notevole efficacia nei pazienti positivi a CCML BCR-ABL13. Il targeting terapeutico delle fusioni geniche oncogeniche ha avuto successo anche nei tumori solidi, con l’inibizione dei geni di fusione ALK e ROS1 nel cancro del polmone non a piccole cellule che funge da esempi primari4,5. Recentemente, l’inibitore NTRK larotrectinib è stato approvato dalla FDA per i tumori solidi NTRK1/2/3 con grado di fusione positivi, indipendentemente dal sito della malattia6. Oltre alla selezione della terapia, il rilevamento della fusione genica ha anche ruoli nella diagnosi e nella prognosi della malattia. Ciò è particolarmente diffuso in vari sottotipi di sarcoma e malignità ematologica che sono definiti diagnosticamente dalla presenza di fusioni specifiche e/o per i quali la presenza di una fusione direttamente in forma prognosi7,8 , 9 (in vie , 10 del sistema , 11.Questi sono solo alcuni esempi dell’applicazione clinica del rilevamento della fusione genica per i pazienti oncologici.
A causa del ruolo fondamentale nel processo decisionale clinico, la rilevazione accurata della fusione genica da campioni clinici è di vitale importanza. Numerose tecniche sono state applicate nei laboratori clinici per l’analisi di riorganizzazione della fusione o cromosomica, tra cui: tecniche citogenetiche, reazione a catena di polimerasi di trascrizione inversa (RT-PCR), fluorescenza nell’ibridazione situ (FISH), immunohistochimica (IHC) e 5’/3′ analisi dello squilibrio di espressione (tra gli altri)12,13,14,15. Attualmente, l’elenco in rapida espansione delle fusioni di geni utilizzabili nel cancro ha portato alla necessità di valutare contemporaneamente lo stato di fusione di più geni. Di conseguenza, alcune tecniche tradizionali che possono interrogare solo uno o pochi geni alla volta stanno diventando approcci inefficienti, soprattutto se si considera che i campioni di tumore clinico sono spesso molto finiti e non suscettibili di essere divisi tra diversi saggi. Il sequenziamento di nuova generazione (NGS), tuttavia, è una piattaforma di analisi adatta per i test multigeni, e i saggi basati su NGS sono diventati comuni nei laboratori clinici di diagnostica molecolare.
I saggi NGS attualmente utilizzati per il rilevamento della fusione/riarrangiamento variano per quanto riguarda il materiale di input utilizzato, le funzioni chimiche impiegate per la preparazione della biblioteca e l’arricchimento dei bersagli e il numero di geni interrogati all’interno di un’analizzazione. I saggi NGS possono essere basati su RNA o DNA (o entrambi) estratti dal campione. Sebbene l’analisi basata sull’RNA sia ostacolata dalla tendenza dei campioni clinici a contenere RNA altamente degradato, elude la necessità di sequenziare introni grandi e spesso ripetitivi che sono gli obiettivi di test di fusione basati su DNA, ma si sono dimostrati difficili per NGS analisi dei dati16. Le strategie di arricchimento target per i saggi NGS basati sull’RNA possono essere in gran parte suddivise in approcci ibridi di cattura o di amplicon mediazione. Mentre entrambe le strategie sono state utilizzate con successo per il rilevamento della fusione, ognuna contiene vantaggi rispetto alle altre17,18. I saggi di cattura ibrida in genere si traducono in librerie più complesse e in un abbandono allelico ridotto, mentre i saggi basati su amplicon richiedono generalmente un input inferiore e comportano un sequenziamento meno off-target19. Tuttavia, forse la limitazione primaria dell’arricchimento tradizionale basato sull’amplicon è la necessità di primer per tutti i partner di fusione conosciuti. Questo è problematico poiché molti geni clinicamente importanti sono noti per fondersi con decine di partner diversi, e anche se la progettazione del primer permettesse di rilevare tutti i partner noti, nuovi eventi di fusione rimarrebbero inosservati. Una tecnica descritta di recente definita multiplex PCR (o AMP in breve) affronta questa limitazione20. In AMP, un adattatore NGS “semifunzionale” è migate a frammenti di cDNA derivati dall’RNA di input. L’arricchimento del bersaglio si ottiene amplificando tra primer specifici del gene e un primer all’adattatore. Di conseguenza, tutte le fusioni con geni di interesse, anche se è coinvolto un nuovo partner di fusione, dovrebbero essere rilevate (vedi Figura 1). Questo articolo descrive l’uso del kit ArcherDx FusionPlex Solid Tumor, un saggio basato su NGS che impiega AMP per l’arricchimento del bersaglio e la preparazione della libreria, per il rilevamento di fusioni geniche oncogeniche in campioni di tumori solidi (vedere la tabella supplementari 1 per dell’elenco completo dei geni). Il protocollo wet-bench e le fasi di analisi dei dati sono stati rigorosamente convalidati in un laboratorio certificato CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments).
Protocol
Representative Results
Discussion
L’arricchimento e la preparazione della libreria basati su PCR multiplex ancorati seguiti dal sequenziamento di nuova generazione sono adatti per la valutazione della fusione genica multiplexneista in campioni di tumore clinici. Concentrandosi sull’input di RNA piuttosto che sul DNA genomico, si evita la necessità di sequenziare introni di grandi dimensioni e ripetitivi. Inoltre, poiché questo approccio amplifica le fusioni geniche indipendentemente dall’identità del partner di fusione, vengono rilevate nuove fusioni….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla Molecular Pathology Shared Resource dell’Università del Colorado (National Cancer Institute Cancer Center Support Grant No. P30-CA046934) e dal Colorado Center for Personalized Medicine.
Materials
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
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