I virus dell’influenza A (IAV) sono patogeni respiratori contagiosi che causano epidemie annuali e pandemie occasionali. Qui, descriviamo un protocollo per monitorare le infezioni virali in vivo utilizzando una nuova luciferasi ricombinante e la fluorescenza-espressione bireporter IAV (BIRFLU). Questo approccio fornisce ai ricercatori un eccellente strumento per studiare IAV in vivo.
I virus dell’influenza A (IAV) causano malattie respiratorie umane associate a conseguenze economiche e sanitarie significative. Come con altri virus, lo studio dello IAV richiede l’uso di laboriosi approcci secondari per rilevare la presenza del virus nelle cellule infette e/o nei modelli animali di infezione. Questa limitazione è stata recentemente aggirata con la generazione di IAV ricombinanti che esprimono proteine reporterstiche fluorescenti o bioluminescenti (luciferasi) facilmente tracciabili. Tuttavia, i ricercatori sono stati costretti a selezionare geni di reporter fluorescenti o luciferasi a causa della limitata capacità del genoma IAV per l’inclusione di sequenze estranee. Per superare questa limitazione, abbiamo generato un bireporter iav (BIRFLU) ricombinante che esprime stabilmente un gene di reporter fluorescente e luciferasi per tracciare facilmente le infezioni IAV in vitro e in vivo. A tal fine, i segmenti virali virali non strutturali (NS) ed emagglutinina (HA) dell’influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) sono stati modificati per codificare rispettivamente la Venere fluorescente e le proteine bioluminescenti Nanoluc luciferasi. Qui, descriviamo l’uso di BIRFLU in un modello murino di infezione da IAV e il rilevamento di entrambi i geni reporter utilizzando un sistema di imaging in vivo. In particolare, abbiamo osservato una buona correlazione tra le espressioni sia dei giornalisti che della replica virale. La combinazione di tecniche all’avanguardia in biologia molecolare, ricerca animale e tecnologie di imaging, fornisce ai ricercatori l’opportunità unica di utilizzare questo strumento per la ricerca influenzale, compreso lo studio delle interazioni virus-ospite e delle dinamiche di infezioni virali. È importante sottolineare che la fattibilità di modificare geneticamente il genoma virale per esprimere due geni estranei provenienti da diversi segmenti virali apre opportunità di utilizzare questo approccio per: (i) lo sviluppo di nuovi vaccini IAV, (ii) la generazione di IAV ricombinanti che possono essere utilizzati come vettori di vaccino per il trattamento di altre infezioni da patogeni umani.
Influenza A virus (IAV) è un virus rna segmentato a senso negativo a singolo filamento avvolto della famiglia Orthomyxoviriridae 1,2,3. L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) stima 3-5 milioni di casi annui di influenza e oltre 250.000 decessi da influenza in tutto il mondo4,5,6. I gruppi particolarmente vulnerabili all’influenza includono gli anziani, gli individui immunocompromessi e i bambini7,8,9,10,11. Sebbene i vaccini siano disponibili e rappresentino l’intervento più comune ed efficace contro l’infezione virale, lo IAV è in grado di evolvere rapidamente e sfuggire all’immunità preesistente3,12,13, 14 Del sistema , 15. Il riemergere di un ceppo pandemico H1N1 nel 2009 e l’emergere di iAV patogeni ribadisce la costante minaccia alla salute pubblica umana in tutto il mondo4,16.
Durante un’epidemia o una pandemia, è fondamentale determinare rapidamente la patogenicità e la trasmissibilità dei virus appena isolati. Attualmente disponibili tecniche per rilevare il virus sono lunghe e talvolta richiedono l’uso di approcci laboriosi, che possono ritardare il completamento di queste analisi17,18,19,20. Inoltre, gli attuali saggi virali sono difficili da scalare, il che potrebbe essere necessario in caso di epidemia. Infine, l’uso di modelli animali convalidati di infezione, come topi, porcellini d’India e furetti, è usato regolarmente e sono fondamentali per studiare le infezioni influenzali, le risposte immunitarie e l’efficacia di nuovi vaccini e/o antivirali. Tuttavia, questi modelli sono restrittivi a causa dell’incapacità di osservare le dinamiche virali in tempo reale; questo limita gli studi all’imaging statico delle infezioni virali21,22,23,24,25. Anche gli animali utilizzati in questi saggi sono eutanasia per determinare il carico virale, aumentando così il numero di animali necessari per completare questi studi26. Per aggirare tutte queste limitazioni, molti ricercatori si affidano all’uso di IAV ricombinanti, competenti e giornalistici, in grado di accelerare i saggi virologici e rilevare il carico virale e la diffusione in tempo reale26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. È importante sottolineare che questi IAV che esprimono i reporter sono in grado di replicarsi in modo simile agli IAV wild-type (WT) nella coltura cellulare e nei modelli animali di infezione33,42.
Le proteine fluorescenti e bioluminescenti sono due sistemi di reporter comunemente utilizzati dai ricercatori a causa della loro sensibilità, stabilità e facilità d’uso. Inoltre, c’è un enorme supporto e progresso nelle tecnologie di rilevamento delle proteine fluorescenti e bioluminescenti43,44,45,46,47,48 . Le proteine fluorescenti e le luciferasi hanno proprietà diverse che permettono loro di brillare, in particolare diverse per quanto vengono generati gli stati eccitati e come viene rilevata l’emettitore43,44,45, 46,47,48. Le proteine fluorescenti sono prima eccitate assorbendo energia, che viene successivamente rilasciata come luce a una diversa lunghezza d’onda come le molecole diminuiscono a uno stato di energia inferiore43. D’altra parte, la bioluminescenza è derivata da una reazione esotermica chimica che coinvolge un substrato, ossigeno, e talvolta ATP al fine di produrre luce45. A causa delle diverse proprietà di questi due tipi di proteine reporter, uno forse più vantaggioso dell’altro a seconda dello studio di interesse. Mentre le proteine fluorescenti sono ampiamente utilizzate per osservare la localizzazione cellulare28,41, i loro segnali in vivo hanno un’intensità inadeguata e sono spesso oscurati dall’autofluorescenza nei tessuti vivi49. Pertanto, i ricercatori si basano su luciferasi per valutare la dinamica virale negli organismi vivi, anche se le proteine fluorescenti possono essere preferite per gli studi ex vivo50,51,52,53. A differenza delle proteine fluorescenti, le luciferasi sono più convenienti per gli studi in vivo e più applicabili negli approcci non invasivi26,27,28,29,30 , 31 Milia , 32 Milia risse , 33 Mi lasa , 34 Mi lasa , 35 Mi lasa , 36 Mi lasa , 37 Mi lasa’ di , 38 Mi lasa , 39 mila: l’altro , 40 anni ( , 41 del sistema , 54.In ultima analisi, sulla base del tipo di studio, i ricercatori devono scegliere tra l’uso di una proteina fluorescente o lucidferasi come loro lettura, che sottopone il loro studio a un compromesso di funzionalità e sensibilità, e gravemente limita l’utilità dei virus del reporter ricombinante. Inoltre, vi sono preoccupazioni circa la correlazione tra l’espressione di diversi geni reporter utilizzando sistemi di fluorescenza o luciferasi e la replica o diffusione virale, che potrebbe compromettere l’interpretazione dei dati ottenuti con giornalisti che esprimono IAV.
Abbiamo superato questa limitazione generando una replica ricombinante-competente Bi-reporter IAV (BIRFLU) che codifica sia per una proteina fluorescente e una lucidferasi nello stesso genoma virale55 (Figura 1). Qui, NanoLuc luciferate (Nluc), una piccola e luminosa proteina bioluminescente48, è stata inserita a monte della sequenza di emagglutinina (HA) nel segmento HA virale dell’influenza A/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. Inoltre, Venere, una proteina fluorescente monomerica di uso frequente, è stata inserita nel segmento virale non strutturale (NS)32,33,36,41,55. Poiché BIRFLU codifica per geni di reporter fluorescenti e luciferasi, il segnale proteico del reporter può essere utilizzato come lettura per determinare la replicazione virale e la diffusione in vitro o in vivo55. Ulteriori informazioni riguardanti la generazione e la caratterizzazione in vitro o in vivo di BIRFLU sono reperibili nella nostra recente pubblicazione55. BIRFLU può essere utilizzato per testare l’efficacia dei farmaci antivirali o neutralizzare gli anticorpi attraverso un nuovo test di microneutralizzazione fluorescente e bioluminescente55. Inoltre, BIRFLU può essere utilizzato anche per valutare la dinamica virale in un modello murino di infezione55. In questo manoscritto vengono descritte le procedure per caratterizzare BIRFLU55 in vitro e come studiare l’infezione da CANNAFLU nei topi utilizzando sistemi di imaging della luminescenza in vivo per l’individuazione di Nluc in vivo o di Venere ex vivo.
La combinazione di tecniche all’avanguardia in biologia molecolare, ricerca animale e tecnologie di imaging, offre ai ricercatori l’opportunità unica di utilizzare BIRFLU per la ricerca IAV, compreso lo studio delle interazioni virus-ospite, le dinamiche dell’infezione virale; lo sviluppo di nuovi approcci vaccinali per il trattamento terapeutico delle infezioni da IAV o il potenziale uso di IAV come vettore di vaccino per il trattamento di altre infezioni patogene.
I ricercatori si sono affidati a virus ricombinanti che esprimono i virus come strumenti molecolari vitali per comprendere ed espandere l’attuale comprensione della replicazione virale e della patogenesi26,27,28, 29 del 22 221 , 30 milio , 31 Milia , 32 Milia risse , 33 Mi lasa , 34 Mi lasa , 35 Mi lasa , 36 Mi lasa , 37 Mi lasa’ di , 38 Mi lasa , 39 mila: l’altro , 40 anni ( , 41 del sistema , 54. I geni reporter più comunemente favoriti sono le luciferasi e le proteine fluorescenti, principalmente a causa dei progressi tecnologici nella loro identificazione, nello sviluppo di varianti migliorate e nel rilevamento da parte delle tecnologie di imaging43 , 44 (di sistema) , 45 anni , 46 per quanto , 47 o , 48. I virus dei reporter ricombinanti sono spesso utilizzati per accelerare i saggi virologici, studiare le dinamiche dei virus in vitro e in vivo, e per testare l’efficacia degli approcci terapeutici e di vaccino attualmente approvati o nuovi,26, 27 ,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Purtroppo, nel caso dello IAV, gli studi passati sono stati limitati all’espressione di un singolo gene reporter, che ostacola il tipo di studio che potrebbe essere condotto 26,27,28,29 , 30 milio , 31 Milia , 32 Milia risse , 33 Mi lasa , 34 Mi lasa , 35 Mi lasa , 36 Mi lasa , 37 Mi lasa’ di , 38 Mi lasa , 39 mila: l’altro , 40 anni ( , 41 del sistema , 54. Per evitare questa limitazione, abbiamo generato un bireporter competente alla replica Che esprime una luciferasi Nluc e una proteina fluorescente di Venere (BIRFLU).
In questa relazione, descriviamo la caratterizzazione in vitro di BIRFLU e gli approcci sperimentali per utilizzare BIRFLU per monitorare l’infezione virale in vivo utilizzando un modello murino di infezione da IAV. L’espressione BIRFLU Nluc e Venere è correlata ai titer virali. Inoltre, BIRFLU è rimasta stabile e ha continuato ad esprimere entrambi i geni dei reporter dopo essere stata recuperata dai polmoni dei topi infetti. Questo approccio offre ai ricercatori un’ottima opportunità per studiare lo IAV in cellule coltivate e in modelli animali, compresa l’identificazione e lo sviluppo di nuove alternative terapeutiche per il trattamento delle infezioni da IAV.
Sebbene BIRFLU sia stato generato utilizzando la spina dorsale della PR8, altri IAV ricombinanti che utilizzano backbone di tipo, sottotipo o virale di tipo diverso potrebbero essere generati utilizzando lo stesso approccio sperimentale. Allo stesso modo, in questa relazione abbiamo descritto le procedure sperimentali per l’uso di BIRFLU in un modello murino di IAV. Tuttavia, BIRFLU potrebbe essere una tecnologia preziosa per valutare l’infezione da IAV in altri modelli animali.
The authors have nothing to disclose.
La ricerca sul virus dell’influenza nel laboratorio LM-S è parzialmente finanziata dal New York Influenza Center of Excellence (NYICE) (NIH 2722014000055C), membro del contratto NIAID Centers of Excellence for Excellence Research and Surveillance (CEIRS) No. HHSN272201400005C (NYICE) e dal Dipartimento della Difesa (DoD) Peer Reviewed Medical Research Program (PRMRP) concedere W81XWh-18-1-0460.
12-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 665102 | |
24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
Adobe Photoshop CS4 | Adobe | This software is used in 3.1.10 and 4.4.7 | |
Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4° C |
Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
ChemiDoc MP Imaging System | BioRad | This instrument is used in 4.4.7 | |
Crystal Violet | Thermo Fisher Scientific | C581-100 | Store at Room temperature |
Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
Five- to seven-week-old female BALB/c mice | National Cancer Institute (NCI) | 555 | |
Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at Room temperature |
IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) |
IX81 Motorized Inverted Microscope | Olympus | Olympus IX81 | |
Living Image 4.7.2 software | PerkinElmer | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) | |
Lumicount | Packard | This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6) | |
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATCC | H16-L10-4R5 | Store at -20 °C |
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scientific | 269620 | |
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x | Corning | 30-00-CI | Store at -20 °C |
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
Retiga 20000R Fast1394 Camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
Scanner | HP | ||
Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies | Jackson | 715-075-150 | Store at -20 °C |
Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20 °C |
Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices |