Summary

Análisis del contenido de gotas de lípidos en fesión y levaduras en ciernes mediante el procesamiento automatizado de imágenes

Published: July 17, 2019
doi:

Summary

Aquí, presentamos una implementación de MATLAB de detección automatizada y descripción cuantitativa de gotas de lípidos en imágenes de microscopía de fluorescencia de fission y células de levadura en ciernes.

Abstract

El metabolismo de los lípidos y su regulación son de interés tanto para las ciencias básicas y aplicadas de la vida como para la biotecnología. En este sentido, varias especies de levadura se utilizan como modelos en la investigación metabólica de lípidos o para la producción de lípidos industriales. Las gotas lipídicas son cuerpos de almacenamiento altamente dinámicos y su contenido celular representa una lectura conveniente del estado metabólico lipídico. La microscopía de fluorescencia es un método de elección para el análisis cuantitativo de gotas de lípidos celulares, ya que se basa en equipos ampliamente disponibles y permite el análisis de gotas de lípidos individuales. Además, el análisis microscópico de imágenes se puede automatizar, lo que aumenta considerablemente el rendimiento general del análisis. Aquí, describimos un flujo de trabajo experimental y analítico para la detección automatizada y descripción cuantitativa de gotas de lípidos individuales en tres especies de levaduras de modelo diferentes: las levaduras de fission Schizosaccharomyces pombe y Schizosaccharomyces japonicus, y la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae. Las gotas de lípidos se visualizan con BODIPY 493/503, y el dextran fluorescente impermeable a la celda se agrega a los medios de cultivo para ayudar a identificar los límites celulares. Las células se someten a microscopía de epifluorescencia 3D en canales verdes y azules y las imágenes de la pila z resultantes se procesan automáticamente mediante una canalización matlab de MATLAB. El procedimiento genera datos cuantitativos enriquecidos sobre el contenido de gotas de lípidos celulares y las características individuales de las gotas de lípidos en un formato tabular adecuado para análisis posteriores en hojas de cálculo principales o paquetes estadísticos. Proporcionamos análisis de ejemplo del contenido de gotas de lípidos bajo diversas condiciones que afectan el metabolismo celular de los lípidos.

Introduction

Los lípidos desempeñan un papel crucial en la energía celular y el metabolismo del carbono, la síntesis de componentes de membrana y la producción de sustancias bioactivas. El metabolismo de los lípidos se ajusta según las condiciones ambientales, la disponibilidad de nutrientes y la fase1del ciclo celular. En los seres humanos, el metabolismo de los lípidos se ha conectado a enfermedades, como la obesidad, la diabetes tipo II y el cáncer2. En la industria, los lípidos producidos por microorganismos, como las levaduras, representan una fuente prometedora de combustibles diésel renovables3. Las células almacenan lípidos neutros en las llamadas gotas lipídicas (LD). Estos cuerpos evolutivamente conservados se componen de triacilgliceroles, ésteres de esteril, una monocapa fosfolípido externa y proteínas asociadas1. Los LM se originan en el retículo endoplasmático, ejercen dinámicas de ciclo celular o fase de crecimiento, y son importantes para la homeostasis lipídica celular1. El número de LD y la morfología se pueden utilizar como un proxy conveniente al analizar el metabolismo de los lípidos bajo diversas condiciones de crecimiento o al examinar un panel de mutantes. Dada su naturaleza dinámica, las técnicas capaces de analizar las propiedades de los DNl individuales son de particular interés en los estudios del metabolismo lipídico.

Varias especies de levadura se han utilizado para describir las vías metabólicas relacionadas con los lípidos y su regulación, o se utilizan en la biotecnología para producir compuestos o combustibles interesantes1. Además, para levaduras modelo, tales como la levadura en ciernes Saccharomyces cerevisiae o la levadura de fismo distantemente relacionada Schizosaccharomyces pombe, se encuentran disponibles bibliotecas de cepas de eliminación en todo el genoma que se pueden utilizar para un alto rendimiento pantallas4,5. Recientemente la composición y dinámica de LD se han descrito en S. pombe6,7,8,9, y mutantes relacionados con el metabolismo lipídico se han aislado en el modelo emergente de levadura Schizosaccharomyces japonicus10.

Numerosas técnicas están disponibles para estudiar el contenido y la dinámica de LD. La mayoría emplea algún tipo de tinción de Lutsisconlos con colorantes lipofílicos como Nile Red o BODIPY 493/503. Este último muestra espectros de excitación y emisión más estrechos, y una mayor especificidad hacia los lípidos neutros (LD) en comparación con los fosfolípidos (membranas)11. Los métodos fluorimétricos y de citometría de flujo se han utilizado con éxito en varias especies de hongos para descubrir genes y condiciones de crecimiento que afectan al contenido de lípidos de almacenamiento12,13,14,15. Si bien estos métodos son adecuados para aplicaciones de alto rendimiento, no pueden medir el número y la morfología de los D Individuales en las células, lo que puede diferir drásticamente entre las condiciones de crecimiento y los genotipos. La dispersión coherente de Raman o la microscopía holográfica digital son métodos sin etiquetas que producen datos a nivel de LD, pero requieren equipos especializados y costosos16,17,18. La microscopía de fluorescencia, por otro lado, puede proporcionar datos detallados sobre el contenido de LD, al tiempo que utiliza instrumentos comúnmente disponibles y herramientas de software de análisis de imágenes. Existen varios flujos de trabajo de análisis que cuentan con varios grados de sofisticación y automatización en la detección de celdas/LD a partir de datos de imagen, y están optimizados para diferentes tipos de celdas, como células metazoanas con grandes LD19,20 , 21, o levaduras en ciernes17,22,23. Algunos de estos enfoques solo funcionan en 2D (por ejemplo, en imágenes de proyección máxima), lo que puede no describir de forma fiable el contenido de LD celular. Hasta nuestro conocimiento, no existen herramientas para la determinación del contenido de LD y la morfología a partir de datos microscópicos de levadura de fesión. El desarrollo de análisis automatizados y robustos a nivel de LD traería mayor sensibilidad y mayor potencia estadística, y proporcionaría información rica sobre el contenido de lípidos neutros, idealmente en múltiples especies de levaduras.

Hemos desarrollado un flujo de trabajo para el análisis de contenido LD a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia 3D de células de levadura. Las celdas vivas se tiñen con BODIPY 493/503 y Cascade Blue dextran para visualizar los DD y determinar los límites de las celdas, respectivamente. Las células se inmovilizan en diapositivas de vidrio y se someten a imágenes de pila z utilizando un microscopio de epifluorescencia estándar. Las imágenes son procesadas por una canalización automatizada implementada en MATLAB, un paquete ampliamente utilizado (comercial) para análisis estadísticos. La canalización realiza el preprocesamiento de imágenes, la segmentación (células frente al fondo, la eliminación de celdas muertas) y la identificación de LD. Los datos enriquecidos a nivel de LD, como el tamaño de LD y la intensidad de la fluorescencia, se proporcionan en un formato tabular compatible con las principales herramientas de software de hoja de cálculo. El flujo de trabajo se utilizó con éxito para determinar el impacto de la disponibilidad de la fuente de nitrógeno en el metabolismo de los lípidos en S. pombe24. Ahora demostramos la funcionalidad del flujo de trabajo en S. pombe, S. japonicus y S. cerevisiae,utilizando condiciones de crecimiento o mutantes que afectan el contenido de LD celular.

Protocol

1. Preparación de soluciones y medios de comunicación Prepare la solución de tinción de lípidos. Para preparar la solución de tinción de lípidos en stock disolver 10 mg de BODIPY 493/503 en 10 ml de DMSO anhidro (concentración final 1 mg/ml). Disolver todo el contenido de un vial de 10 mg de BODIPY 493/503 para evitar la pérdida de material durante el pesaje.PRECAUCION: La DMSO puede pasar a través de la piel. Use el equipo de protección personal adec…

Representative Results

Todo el procedimiento se resume en la Figura 1 para las levaduras de fisión (el flujo de trabajo de levadura en ciernes es análogo), y a continuación proporcionamos ejemplos de cómo el flujo de trabajo se puede utilizar para estudiar el contenido de LD en tres especies de levadura diferentes en diversas condiciones conocidas para afectar el contenido de LD celular. Cada ejemplo representa un único experimento biológico. <img …

Discussion

La comprensión del metabolismo lipídico y su regulación es importante tanto para la biología básica, como para las aplicaciones clínicas y biotecnológicas. El contenido de LD representa una lectura conveniente del estado del metabolismo de los lípidos de la célula, siendo la microscopía de fluorescencia uno de los principales métodos utilizados para la determinación del contenido de LD. El protocolo presentado permite la detección automatizada y la descripción cuantitativa de los D Individuales en tres espe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por las becas de la Universidad Charles PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 y SVV 260310. Agradecemos a Ond-ej éebesta por la ayuda con la microscopía y el desarrollo de la canalización de análisis de imágenes. Agradecemos al laboratorio de ReGenEx por las cepas de S. cerevisiae, y al laboratorio de JapoNet y Hironori Niki para las cepas de S. japonicus. La cepa ppc1-88 fue proporcionada por The Yeast Genetic Resource Center Japan. La microscopía se realizó en el Laboratorio de Microscopía Confocal y fluorescencia cofinanciado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional y el presupuesto estatal de la República Checa (Proyecto no. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 y CZ.2.16/3.1.00/21515).

Materials

12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG Hamamatsu   or equivalent
Adenine hemisulfate salt, ≥99% Merck A9126-25G  
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) Thermo Fisher Scientific D3922 for neutral lipid staining
D-(+) – Glucose, ≥99.5% Merck G7021  
Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable Thermo Fisher Scientific D1976 for negative staining of cells
Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% Merck D4540 or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves
EMM broth without dextrose Formedium PMD0405 medium may also be prepared from individual components
Fiji/ImageJ software NIH   or equivalent; for visual inspection of microscopic data
High precision cover glasses, 22×22 mm, No 1.5 VWR 630-2186 use any # 1.5 cover glass
Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 Mathworks    
Lectin from Glycine max (soybean) Merck L1395 for cell immobilization on slides
MATLAB software, version 9.2 Mathworks    
Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness Knittel Glass L762601.2 use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells
Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement Olympus   or equivalent
pentaband filter set Semrock F66-985 brightfield, green and blue channels are sufficient
Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 Mathworks    
SP supplements Formedium PSU0101  
standard office computer capable of running MATLAB      
Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 Mathworks    
Universal peptone M66 for microbiology Merck 1070431000  
UPLSAPO 60XO objective Olympus   or equivalent
Yeast extract Formedium YEA03  
Yeast nitrogen base without amino acids Formedium CYN0405  

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Princová, J., Schätz, M., Ťupa, O., Převorovský, M. Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing. J. Vis. Exp. (149), e59889, doi:10.3791/59889 (2019).

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