Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung der einzelnen frisch isolierten Detrusor glatten Muskelzellen aus menschlichen Harnblasenproben mit einem zweistufigen enzymatischen Verfahren. Die erhaltenen lebensfähigen DSM-Zellen können mit verschiedenen Einzelzelltechniken untersucht werden, einschließlich der beschriebenen Amphotericin-B-Patch-Clamp-Elektrophysiologie, um physiologische und pharmakologische Eigenschaften aufzudecken.
Detrusor glatte Muskel (DSM) Zellen in der Harnblase Wand vorhanden schließlich erleichtern Urin Lagerung und Leerung. Die Vorbereitung der lebensfähigen, frischen und isolierten DSM-Zellen stellt eine wichtige technische Herausforderung dar, deren Leistung optimale Zellen für nachfolgende funktionelle und molekulare Studien bietet. Die hier entwickelte und ausgearbeitete Methode, die von unserer Gruppe seit über einem Jahrzehnt erfolgreich eingesetzt wird, beschreibt die Zerlegung menschlicher Harnblasenproben, die aus offenen Blasenoperationen gewonnen wurden, gefolgt von einer enzymatischen zweistufigen Behandlung von DSM-Stücken und mechanischer Triturierung, um frisch isolierte DSM-Zellen zu erhalten. Der erste Schritt beinhaltet die Zerlegung, um die DSM-Schicht (auch bekannt als muscularis propria) von der Schleimhaut (Urothelium, Lamina Propria und Muscularis Mucosa) und dem angrenzenden Binde-, Gefäß- und Fettgewebe zu trennen. Der DSM wird dann in Stücke geschnitten (2-3 mm x 4-6 mm) in nominell Ca2+-haltige Rortungs-/Verdauungslösung (DS). DSM-Stücke werden als nächstes auf DS-haltiges Papain und Kollagennase bei 37 °C für 30-45 min pro Schritt übertragen und nacheinander getrennt behandelt. Nach dem Einwaschgerät mit DS- enthaltendem enzymfreien Rinderserum und Trituration mit einer feuerpolierten Pipette setzen die Stücke einzelne DSM-Zellen frei. Frisch isolierte DSM-Zellen eignen sich ideal für elektrophysiologische und pharmakologische Charakterisierungen von Ionenkanälen. Insbesondere zeigen wir, dass der TRPM4-Kanalblocker 9-Phenanthrol spannungsschrittsevoktionierte Kationströme reduziert, die mit dem perforierten Patch-Clamp-Ansatz von Amphotericin-B aufgezeichnet wurden. DSM-Zellen können auch mit anderen Techniken wie einzellige RT-PCR, Mikroarray-Analyse, Immunzytochemie, In-situ-Näherungligationassay und Ca2+ Bildgebung untersucht werden. Der Hauptvorteil der Verwendung einzelner DSM-Zellen besteht darin, dass sich die gemachten Beobachtungen direkt auf einzelne Zellmerkmale beziehen, die aufgedeckt wurden. Studien an frisch isolierten menschlichen DSM-Zellen haben wichtige Erkenntnisse geliefert, die die Eigenschaften verschiedener Ionenkanäle charakterisieren, einschließlich kationdurchlässig in der Harnblase und werden als Goldstandard bei der Aufklärung der zellulären Eigenschaften und Regulatorischen Mechanismen von DSM fortgesetzt.
Detrusor glatte Muskelzellen (DSM) Zellen bilden die am häufigsten vorkommende Zelltyp in der Harnblase und schließlich Kontrolle Urin Lagerung und Leerung durch Entspannung und Kontraktion, beziehungsweise. DSM-Zellen bilden glatte Muskelbündel, die mit angrenzendem Bindegewebe, Nervenprozessen, interstitiellen Zellen und anderen Zelltypen1verzahnt sind. Das aktuelle Verständnis der Rolle von DSM-Zellen in der Harnblasenfunktion wurde durch einen mehrstufigen integrierten Ansatz erreicht. Jede experimentelle Methode – ob auf der Grundlage isolierter Einzelzellen in vitro, Gewebestreifen mit glatten Muskelbündeln in vitro/ex vivo oder In-vivo-Bestimmungen (wie Zytometrie und Leerungsfunktion) – liefert wichtige und spezifische Einblicke in physiologische und pharmakologische Eigenschaften von DSM (siehe Reviews1,2,3,4,5,6 für Details). Die Interpretation der Ergebnisse isolierter Einzelzellen ermöglicht es jedoch, Schlussfolgerungen speziell dem Einzelzelltyp selbst zuzuschreiben. Diese Erkenntnis war die treibende Kraft für die Etablierung einer zuverlässigen und reproduzierbaren Methode zur Gewinnung frisch isolierter DSM-Zellen aus den gesamten Dicken-Harnblasenproben. Im Gegensatz zu vielen anderen Zelltypen können glatte Muskelzellen aufgrund des Verlustes ihres nativen Phänotyps nicht zuverlässig kultiviert werden, einschließlich spezifischer Veränderungen ihrer elektrophysiologischen und kontraktilen Eigenschaften7,8. Diese Tatsache unterstreicht die Bedeutung von Studien an physiologisch aktiven, frisch isolierten DSM-Zellen.
In den späten 1980er und frühen 1990er Jahren veröffentlichte Isenbergs Gruppe (Deutschland) eine Reihe elektrophysiologischer Studien an frisch isolierten DSM-Zellen, die aus Meerschweinchen-Harnblasen9,10,11,12,13 ( Tabelle1) gewonnen wurden. Die Methode hob zwei wichtige Beobachtungen hervor, die bei der Gewinnung lebenswichtiger Zellen halfen und als erste Leitlinie für andere dienten. Sie behandelten 1) isolierte DSM-Stücke mit Ca2+-freier Lösung/Medium vor der enzymatischen Behandlung und 2) Gewebeverdauung mit einer Lösung, die Kollagennase enthält. Diese beiden kritischen Schritte wurden in alle nachfolgenden Varianten von DSM-Zelltrennungsverfahren integriert (Tabelle 1). Derzeit verwendet unsere Gruppe einen zweistufigen sequenziellen Ansatz zur Dissoziation von Papain-Kollagenase. DSM-Stücke werden zunächst mit einer Enzymlösung behandelt, die Papain enthält, und dann mit Kollagenase Typ II, die in der gleichen Lösung (DS, Dissektions-/Verdauungslösung) solubilisiert werden. Dieser Ansatz ergibt einzelne DSM-Zellen verschiedener Arten, darunter Meerschweinchen, Schwein, Ratte, Maus und vor allem Menschen (Tabelle 1).
Einzelne DSM-Zellen bieten eine Quelle für mehrere molekularbiologische und physiologische Experimente. Bisher wurden Protein- und mRNA-Expressionsmitnoniden mit Immunzytochemie, oder RT-PCR/qRT-PCR-Bestimmungen ergaben hohe Detektionsniveaus für verschiedene Ionenkanäle, einschließlich der großen Leitfähigkeitsspannung- und Ca2+-aktiviert (BK), kleiner Leitfähigkeit Ca2+-aktiviert K+ Typ 3 (SK3), spannungsgekabelte K+ (Kv), L-Typ spannungsbewehrte Ca2+ (Cav), und transiente Rezeptorpotential-Melastatin Typ 4 (TRPM4) Kanäle, sowie ein Na/Ca2+ Austauscher 14,15,16,17,18,19,20,21,22. Sie alle sind gedacht, um DSM Erregbarkeit zu steuern, intrazelluläre Ca2 + Ebenen und Kontraktilität. Elektrophysiologische Ansätze mit Patch-Clamp, die direkt an Meerschweinchen-, Maus-, Ratten- oder menschlichen DSM-Zellen durchgeführt werden, lieferten einen direkten Nachweis der biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften von L-Typ Cav, Kv (Kv2.x. Kv7), SK, BK und TRPM4 Kanäle17,19,20,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30,31. Die Ansätze umfassten eine konventionelle Ganzzell-Spannungsklemme, eine perforierte Spannungsklemme und einkanalige Aufnahmen (Zellen-, Innen- und Außenkonfigurationen). Darüber hinaus lieferte die Membran-Potenzialaufzeichnung von DSM mit einer Stromklemme Beweise dafür, dass zielorientierte pharmakologische Wirkstoffe die Zellerregbarkeit verändern. Zum Beispiel, die TRPM4-Hemmer 9-Phenanthrol induzierte Hyperpolarisation in DSM-Zellen von Menschen, Meerschweinchen, und Ratte Harnleitern19,20,22,31. Unter den verschiedenen elektrophysiologischen Methoden bieten die perforierten Patch-Clamp-Aufnahmen von Amphotericin-B (und Nystatin, Gramicidin und A-Escin) einen entscheidenden Vorteil, da sie intrinsische intrazelluläre Signalmoleküle und -wege erhalten. Nur niedermolekulare Kationen und in geringerem Maße sind Cl– – aber keine Proteine oder Signalmoleküle einschließlich Ca2+ – durch die Plasmamembranporen durchlässig, die durch Amphotericin-B oder Nystatin32gebildet werden. Das erfolgreiche Ergebnis perforierter Patch-Clamp-Experimente hängt von mehreren allgemeinen Variablen ab, die für diese Technik einzigartig sind. Hier beschreiben wir die Details des Verfahrens mit Amphotericin-B, die unsere Gruppe erfolgreich in den Jahren15,22,33,34,35,36,37,38,39.
Vermutlich bleiben nicht-selektive Kationenkanäle einer der am wenigsten verstandenen Kanaltypen in DSM-Zellen. Der erste Bericht eines nicht selektiven kationenähnlichen Kanals stammt aus dem Jahr 1993. Das Papier von Wellner und Isenberg11 beschrieb einen 33 pS Stretch-aktivierten Einzelkanal, der die folgende Rangfolge der Ionenpermeabilität anzeigt: K+>Na+>Cs+>>>Ba2+>Ca2+, und Hemmung der Kanalaktivität durch Gd3+, ein allgemeiner Inhibitor nicht-selektiver Kationenkanäle. Fast ein Jahrzehnt später beschrieben Thorneloe und Nelson40 Na+ durchlässige Kationströme in Maus-DSM-Zellen, die von Gd3+gehemmt wurden, mit Ganzzellaufnahmen. Da molekulare Identitäten nicht-selektiver Kationenkanäle und deren biophysikalische Charakterisierungen noch zu bestimmen sind, sind zukünftige Untersuchungen in diesem Forschungsbereich gerechtfertigt. Das hier beschriebene Protokoll zur Erfassung nichtselektiver Kationenkanalströme – unter Verwendung extrazellulärer und pipetten intrazellulärer Lösungen, die Cs+, TEA+und Nifedipin enthalten (Tabelle 2), die k v- und caologisch milderndeK-v- undCa-v-Ströme – war und bleibt bei elektrophysiologischen Untersuchungen nicht-selektiver Kationenkanäle nützlich. Wir haben dieses spezifische Protokoll verwendet, um das Ausmaß der Hemmung von Ganzzell-Kationströmen durch den TRPM4-Kanalblocker 9-Phenanthrol in Meerschweinchen-, Ratten- und menschlichen DSM-Zellen19,20,22zu bestimmen.
Zusammengenommen bietet das hier beschriebene Verfahren zur Gewinnung frisch isolierter einzeler DSM-Zellen aus der menschlichen Harnblase lebensfähige Zellen, die sich hervorragend für elektrophysiologische Untersuchungen eignen, mit verschiedenen Konfigurationen der Patch-Clamp-Technik, Ca2+-Imaging, Immunocytochemistry, in situ proximal litigation assay und single cell RT-PCR/qRT-PCR sowie fortgeschrittenemolekulare Biologietechniken wie Mikroarrayanalyse, RNA-seq und CHIP-seq. Die Verwendung der perforierten Patch-Clamp-Methode Amphotericin-B bewahrt die native Zellumgebung im Gegensatz zu anderen Konfigurationen. Bei der Durchführung der hier beschriebenen spezifischen Bedingungen, die dazu bestimmt sind, Beiträge von K+ und Ca2+ Strömen in DSM-Zellen zu negieren, zeigen spannungsschrittinduzierte Ströme die Eigenschaften nichtselektiver Kationströme an, die für biophysikalische und pharmakologische Charakterisierungen geeignet sind.
Die hier beschriebenen Verfahren erklären die Schritte bei der Herstellung lebensfähiger, frisch isolierter DSM-Zellen aus ganzdicken menschlichen Harnblasenproben mittels enzymatischer Verdauung und bei der Aufzeichnung von ganzzelligen Kationenströmen, die empfindlich auf den TRPM4-Kanalinhibitor 9-Phenanthrol mit dem perforierten Patch-Clamp-Ansatz amphotericin-B reagieren. Das enzymatische Verfahren beruht auf einer zweistufigen sequenziellen Exposition, die hierin als sequenzielle Papain-Kollagenase-Verdauungsmethode bezeichnet wird. DSM-Gewebe werden zuerst mit Papain und Dithiothreitol (einem Enzymstabilisierungsmittel) unter einem nominellen Ca2+-freien Zustand behandelt, gefolgt im zweiten Schritt von Kollagenase Typ II in Gegenwart von low Ca2+. Die Gründe für die Durchführung der Papain-Verdauung unter niedrigen Ca2+ Bedingungen in glatten Muskelzellen stammen aus den späten 1980er Jahren. Frisch isolierte Karotisarterie glatte Muskelzellen mit Papain vorbereitet zeigte eine längliche Form, zeigte Lebensfähigkeit (Widerstand gegen Trypan Blue Aufnahme) und reagierte auf kontraktile Reize (höhere Ca2+ und Histamin)65. Jahre später wurde diese Methode bei der Herstellung von DSM-Zellen angewendet (siehe Tabelle 1). Die Wahl der Kollagenase Typ II statt anderer Arten bezieht sich auf seine relativ hohe proteolytische Aktivität ideal für glatte Muskelgewebe einschließlich DSM geeignet. Tatsächlich könnte die Kollagenasebehandlung allein einzelne DSM-Zellen ergeben, obwohl eine umfassende Enzymexposition erforderlich ist (ca. 60 min)53,54. Da die Kollagenaseaktivität von Ca2+ abhängt und das Enzym unter den Ca2+-freien Bedingungen inaktiv ist, erfordert eine optimale enzymatische Verdauung von DSM-Stücken die Anwesenheit von Ca2+ 66. In unserem Fall enthält DS-C 100-200 m [Ca2+] (Tabelle 2). Nach der enzymatischen Behandlung werden verdaute DSM-Stücke mehrmals mit kaltem DS ohne Enzyme oder Ca2+ vorsichtig gewaschen, um jedes an Gewebe gebundene Enzym zu entfernen. Das eiskalte DS trägt dazu bei, die DSM-Zellintegrität zu erhalten und die enzymatische Aktivität aller verbleibenden Papain- oder Kollagenase zu begrenzen. Im letzten Schritt setzt die Triturierung enzymbehandelter DSM-Stücke mit einer feuerpolierten Pasteurpipette einzelne DSM-Zellen frei. DSM-Zellen werden entweder sofort in eine Aufnahmekammer für Patch-Clamp-Studien oder andere Arten von Experimenten gelegt oder auf Eis in DS zur späteren Verwendung am selben Tag gelagert (in der Regel innerhalb von 8 Stunden nach der Vorbereitung, aber die Zellen bleiben lebensfähig für bis zu 24 h).
Wir haben mehrere wichtige Überlegungen für die erfolgreiche Erlangung einzelner DSM-Zellen identifiziert. Die erste bezieht sich auf die menschliche DSM-Probenquelle. Um die Gewebeintegrität optimal zu erhalten, werden DSM-Proben aus offenen Blasenoperationen so schnell wie möglich in eiskaltem DS platziert und in einer kalten Umgebung aufbewahrt. Insbesondere wird die Blasenprobe bei chirurgischer Extraktion vom Patienten sofort auf einen vollständig vorbereiteten Beistelltisch im Operationssaal gestellt. Es folgt eine grobe Untersuchung der gesamten Probe (in der Regel bei radikaler oder einfacher Zystektomie) und deren Öffnung. Nach der Sichtprüfung wird ein Stück ganzer Dicke Harnleiter Probe aus einem abgelegenen Bereich der Probe grob unbeteiligt mit Tumor entfernt und sofort in eine Tasse (entweder 50 oder 100 ml) mit kalt (ca. 4 °C) Dissektionlösung (DS)(Tabelle 2) und dann fest mit einem Deckel geschlossen. Aufgrund der geplanten Art der Entnahme des Gewebes werden das OP-Personal und das Hilfspersonal, das die Ernte durchmacht, zu Beginn des operationsreichen Falls alarmiert, um die Materialien zum Zeitpunkt der Gewebeentnahme im Operationssaal zur Verfügung zu haben. Diese Vorsichtsmaßnahmen zusammen mit der routinemäßigen, sich wiederholenden Natur der Verarbeitungsschritte halten die warme Ischämiezeit für das Gewebe – von der Extraktion bis zur Platzierung in den gekühlten Behälter mit DS-Lösung – auf weniger als 5 min. Der Behälter wird dann in einen Kühlschrank oder auf Eis in einem Kühler gelegt, um die kalte Umgebung zu erhalten und (eiskalt) ins Labor transportiert. Sobald die Probe im Labor eintrifft, beginnen Die Sezieren und enzymatischen Dissoziationsschritte. Es ist sehr schwierig vorherzusagen, ob eine bestimmte DSM-Probe nach enzymatischer Dissoziation qualitativ hochwertige DSM-Zellen ergibt, daher gehen wir mit den enzymatischen Dissoziationsschritten fort. In vielen Fällen führt unsere Gruppe parallel zu elektrophysiologischen Experimenten isometrische Spannungsaufzeichnungen auf DSM-Streifen durch, die aus denselben DSM-Proben hergestellt werden. Wir haben herausgefunden, dass wir in der Regel qualitativ hochwertige DSM-Zellen aus Präparaten erhalten können, die auch erfolgreich tragfähige Streifen für isometrische Kontraktionsstudien liefern (unsere unveröffentlichte Beobachtung).
Der zweite Faktor bezieht sich auf unterschiedliche Enzym-Losvariabilitäten. Wir beobachteten, dass sowohl für Papain als auch kollagennase Typ II jedes Mal, wenn eine neue Menge Enzym von einem Lieferanten ankommt, die Enzymaktivität in DS zur Gewebeverdauung variieren kann. Daher optimieren wir routinemäßig die Enzymkonzentration und Inkubationsintervalle für jedes neue Los. Um den Losvariabilitätsbeitrag zu minimieren, bestellen wir größere Mengen des gleichen Loses und stellen eine große Charge von Lagerlösungen in 2 ml Aliquots von Enzymen her und lagern diese bis zum Einsatz bei 20 °C. Im Laufe der Zeit können gefrorene Bestände (die bis zu 2 Wochen gelagert werden) jedoch ihre enzymatische Aktivität verlieren. Die dritte Variable bezieht sich auf die Temperatur der Enzymverdauungsbehandlungen. Enzymatische Aktivitäten von Papain und Kollagenase zeigen Temperaturabhängigkeit. Papain und Kollagenase Typ II zeigen Aktivität in den Temperaturbereichen, die normale Körperphysiologie67,68umfassen. Daher streben wir an, die Enzymbehandlungen stabil bei 37 °C zu halten, um höhere Temperaturen zu vermeiden, um die DSM-Zellintegrität zu erhalten. Die vierte Überlegung betrifft die Variabilität der Qualität der DSM-Zellen, die in jedem Präparat vorhanden sind, von hochlebensfähigen (mit hervorragenden klassischen glatten Muskeleigenschaften) bis hin zu nicht gesunden, überautierten Zellen. Ein verlängertes Enzyminkubationsintervall ist einer der Hauptgründe für die Beschaffung einer hohen Anzahl von geschädigten Zellen. Übermäßige Enzymbehandlungen beeinträchtigen auch die Proteinstrukturen von Ionenkanälen, Rezeptoren und Transportern, was ihre Funktionalität beeinträchtigt. Die Interpretation der Ergebnisse, die aus enzymatisch erhaltenen, frisch isolierten Zellen gewonnen wurden, sollte diese Berücksichtigung berücksichtigen. Die Optimierung der Enzymverdauungsbedingungen zielt darauf ab, den Prozentsatz der hochlebensfähigen Zellen zu erhöhen. Experimentelle Ansätze, die sich auf eine höhere Anzahl lebensfähiger Zellen stützen, wie z. B. Mikroarrayanalysen, erfordern robustere Optimierungen als diejenigen, die erfolgreich an weniger Zellen wie einzelliger Patch-Clamp-Elektrophysiologie oder Ca 2+-Bildgebung durchgeführt werden. Die Berücksichtigung der oben genannten Faktoren hat unsere Forschungsbemühungen in den letzten zehn Jahren bei der Gewinnung hochwertiger Einzel-DSM-Zellen geleitet.
Die perforierte Patch-Clamp-Technik ist seit über einem Vierteljahrhundert ein elektrophysiologischer Ansatz. Mehrere Veröffentlichungen enthalten Einzelheiten zu den technischen69,70,71,72,73. Die Zellperforation kann mit Amphotericin-B, Nystatin, Gramicidin oder32für einen Überblick über die einzelnen). Der Hauptvorteil perforierter Patch-Clamp-Aufnahmen gegenüber anderen elektrophysiologischen Ansätzen besteht darin, dass die native intrazelluläre Umgebung – einschließlich intrazellulärer2+und Signalmoleküle (z.B. cAMP, PKA, Phosphate und Phosphodiesterasen) – erhalten bleibt. Diese Technik eignet sich daher ideal für die Untersuchung von Ganzzell-Ionenkanalströmen und deren Regulierungsmechanismen unter nahezu physiologischen Bedingungen. Ein wichtiger Vorbehalt ist, dass die intrazelluläre Zellzusammensetzung im Gegensatz zu anderen elektrophysiologischen Methoden wie konventionellen Vollzell- und Single-Channel-Aufnahmen (innen- und außen) nicht genau gesteuert werden kann. Nach unserer Erfahrung tragen drei Faktoren routinemäßig zu erfolgreichen experimentellen Ergebnissen von Amphotericin-B-perforierten Patch-Clamp-Experimenten bei. Die erste ist die Qualität der DSM-Zelle, die zum Versuch einer Aufzeichnung ausgewählt wurde. Wenn DSM-Zellen sehr lebensfähig sind und ein semi-kontraktiles (serpentinartiges), kontrastreiches glänzendes Aussehen mit einem klar definierten Halo um die Zelloberfläche aufweisen und fest an der Glasunterseite der Aufnahmekammer befestigen, dann treten Giga-Siegelbildung und Zellperforation relativ einfach auf. Der zweite bzw. dritte Erfolgsfaktor bezieht sich auf die Qualität der Quelle und die Löslichkeit von Amphotericin-B (in Dimethylsulfoxid/DMSO und intrazellulärer Pipettenlösung). Wir beobachteten Diskrepanzen zwischen verschiedenen Lieferanten in Bezug auf Quelle und Losvariabilitäten. Jeden Tag bereiten wir eine frische Lösung von Amphotericin-B-Stammlösung aus Pulver, gefolgt von seiner Verdünnung in intrazellulärer Pipettenlösung. Diese Schritte erfordern eine umfangreiche Beschallung und Wirbelung. Mit frisch zubereiteter Amphotericin-B-haltiger Pipettenlösung, erfolgreicher Zellperforation (+Ca2+, und nicht-selektive Kationströme aus menschlichen, Meerschweinchen-, Maus- und/oder Ratten-DSM-Zellen17,21,22,23,29,30,31,35,60. Hier beschreiben wir Bedingungen für die Aufzeichnung nicht-selektiver Kationströme in menschlichen DSM-Zellen. 9-Phenanthrol, ein Blocker von TRPM4-Kanälen, abgeschwächte Spannungsschritt induzierte Ströme unterstützen die Rolle dieser Kanäle bei der Kontrolle der DSM Erregbarkeit. Als Hinweis, es dauert in der Regel mindestens 45 min nach Erhalt einer Giga-Dichtung und Einleitung der Perforation, um optimal stabile Spannungsschritt induzierte nicht-selektive Kationströme aufzuzeichnen. Spannungsrampen können auch als Alternative zu Spannungs-Schritt-Protokollen verwendet werden30,64. Hier wurde ein Spannungsschrittprotokoll aus einem hyperpolarisierten Haltemembranpotential bevorzugt als ein Rampenprotokoll, da der frühere Ansatz die Wirkung einer spannungsabhängigen Inaktivierung minimiert und eine Mittelung des evozierten Stroms über eine Dauer ermöglicht. eines Spannungsschritts, bei dem die Rampe einen einzelnen Datenpunkt pro Spannung bereitstellt. Letzterer Punkt gilt insbesondere für menschliche DSM-Zellen, da die Ströme während spannungsschritten eine variable Aktivität aufweisen (Abbildung 5UndAbbildung 6). Die amperhotericin-B perforierte Patch-Clamp-Technik war wesentlich für die Identifizierung der Eigenschaften von DSM-Zellen und anderen Zelltypen und wird auch in Zukunft bei der Bereitstellung neuer Entdeckungen helfen. Darüber hinaus können frisch isolierte Einzel-DSM-Zellen erfolgreich zur Messung von Vollzell-K+Cl–, und Ca2+Ströme im konventionellen Modus der Patch-Clamp-Technik, Membranpotentialaufzeichnung mit der Stromklemme und Einkanalaufnahmen, wie unsere bisherigen Berichte23,29,35,64.
Neben einzelligen Patch-Clamp-Methoden können frisch isolierte DSM-Zellen mit anderen technischen Ansätzen wie Ca2+ Imaging, RT-PCR/q-RT-PCR, Immunzytochemie, In-situ-Proximity Ligationassay und genomischen Ansätzen (z.B. Mikroarray, RNA-seq, CHIP-seq)15,18,30,33,34. Da sich die Methode der Einzelzell-Transkriptombestimmung weiter entwickelt und hochsensibel wird, stellen wir uns in zukunfttlich die Fähigkeit vor, elektrische oder pharmakologische Eigenschaften einzelner DSM-Zellen routinemäßig und spezifisch mit ihren Transkriptom-/Proteomprofilen zu verknüpfen. Dies wird durch erstaufnahmemittelige Aufnahme aus einer DSM-Zelle und anschließende Extraktion von mRNA oder Protein, gefolgt von transkriptomischen/proteomischen Analysen, erreicht. Obwohl solche Methoden bereits in Nicht-DSM-Zellen getestet wurden, sind sie derzeit technisch anspruchsvoll, haben keine Empfindlichkeit, um als Routine betrachtet zu werden, und beschränken sich auf den erfolgreichen Nachweis einiger ausgewählter Genprodukte74. Funktionmolekulare Profilexpressionsverknüpfungsstudien, die an DSM-Zellen durchgeführt werden, die aus Harnblasen aus Kontroll- und erkrankten Patientenspendern gewonnen werden, geben Einblicke in physiologische Prozesse, die für das Fahren normaler DSM-Funktionen, die Pathogenese und die Identifizierung wirksamer neuartiger therapeutischer Ansätze unerlässlich sind.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH-R01DK106964 und P20DK123971 Stipendien an Georgi V. Petkov. Die Autoren danken Dr. Viktor Yarotskyy und Frau Sarah Maxwell für die kritische Bewertung des Manuskripts. Wir sind auch den Urologie-Ärzten von MUSC und UTHSC dankbar: Dr. Thomas Keane, Harry Clarke, Stephen Savage, Ross Rames, Sandip Prasad, Jonathan Picard, Christopher Ledbetter und Anthony Patterson sowie die Bewohner von MUSC und UTHSC Urology: Drs. Taylor Vaughan, Samuel Walker Nickles, Matthew Young, Erin Burns, Justin Ellett, Ryan Levey, Austin Younger, Mark Currin, Nima Baradaran, Olugbemisola McCoy, Tracy Tipton, Bryce Wyatt, Alyssa Greiman, Sarah Starosta, Aaron Bloch, Christine Callaway, Lucille Cox, Christian Dewan, Erin Heitman, Bradley Houston, Stephen Legg, Robert S. Libby, Cole Locklear, Kristen Marley, Monica O’Hanlon, Patrick Probst, Cynthia Sharadin, Elizabeth Tourville, Daniel Zapata für ihre Hilfe bei der Sammlung menschlicher Gewebe.
5 ml polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352054 | Tubes for DS containing enzymes used in digestion steps |
9-Phenanthrol | Sigma-Aldrich | 211281 | TRPM4 channel inhibitor |
Amphotericin-B | Fisher | BP928-250 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | European Pharmacopoeia Reference Standards | 5 | Used for patch/cell perforation |
Amphotericin-B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | Used for patch/cell perforation |
Analog vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9006 | Intracellular pipette solution |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | DS |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | Extracellular solution and DS |
Capillary Glass | Sutter | BF150-110-7.5 | Capillary for preparation of pulled patch electrodes |
Cesium hydroxide hydrate | Sigma-Aldrich | C8518 | Intracellular pipette solution |
Clampex ver. 10 software includes data acqusition (Clampex) and analysis (Clampfit) programs | Axon Instruments/ Molecular Devices | pCLAMP-10 | Commerical software and part of patch-clamp rig setup |
Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | DS-C |
CsCl | Sigma-Aldrich | 203025 | Extracellular and intracellular solutions |
Dental wax | Miltex Dental Wax Technologies, Inc. | 18058351 | |
Digital Thermometer with Probe | Fisher Scientific | 15-077-32 | Placed in tissue bath to monitor temperature |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Solvent |
DL-Dithiothreitol (DDT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Reducing agents used together with Papain |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Ca2+ chelator, used in intracellular pipette solution |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | P-97 | Required to pull electrodes with very fine tips |
Floating foam tube rack/holder | VWR Scientific | 82017-634 | Used for holding tubes with enzymes for temperature control |
Glucose | Sigma | G8270 | |
Glutamic acid (Na salt) | Sigma-Aldrich | G1626 | DS |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | pH Buffer |
KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | Extracellular solution |
Low Noise Data Acquisition System | Axon Instruments/ Molecular Devices | Digidata 1440A | Part of patch-clamp rig setup |
Magnetic stirrer | VWR | 01-442-684 | |
MgCl2 (hexahydrate) | Sigma-Aldrich | M2670 | Extracellular and intracellular solutions |
MicroForge | Narishige | MF-830 | Used for fire-polishing electrodes |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Extracellular and intracellular solutions |
NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Nifedipine | Sigma-Aldrich | N7634 | L-type voltage-gated Ca2+ channel blocker |
Nikon inverted microscope, TS100 with T1-SM stage with 5x, 10x, 20x, and 40x objectives | Nikon | Discontinued | Part of Patch-clamp rig setup |
Non-metalic syringe needle, MicroFil | WPI | MF-34G-5 | Filling of intracellular pipette solution |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | DS-P |
Pasteur pipette | FisherBrand | 13-678-20A | Tips are broken off and fire-polished and used for titration of enzymatically treated tissues to release single DSM cells from pieces |
Patch-clamp amplifier | Axon Instruments/ Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | Part of patch-clamp rig setup |
PC computer | DELL | Custom configuration | Part of patch-clamp rig setup |
pH Meter | Aspera Instruments | PH700 | |
Polyethylene tubing | Intramedic | 427-436 | Tubing for superfusion of extracellular bath connected to glass-bottom recording chamber |
Tetraethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | T2265 | Ion channel blocker of Kv and BK channels added to the extracellular bath solution |
Thermo Scientific Precision shaking water bath (model 2870) | Thermo Scientific | Discontinued | Water bath for temperature control of enzymatic digestion employed as an alternative to tissue chamber-circulating bath setup |
Tissue bath, 100 mL | Radnoti | 1583-101 | Connected to a circulating bath and filled with water, tubes with DS and DSM pieces are placed in the setup to control the temperature of digestion steps |
Vinyl tubing | ColePalmer | 06405-3 | Multiple uses including for connecting tissue bath to circulating water bath |
Water circulator bath, Haake D1 L | Haake | Discontinued | Connected to tissue bath |
Weighting scale | Mettler Toledo | XS64 | |
ZeissAxiovert 40C inverted microscope with 10x and 40x objectives | Carl-Zeiss | Discontinued | Part of patch-clamp rig setup |