Summary

ウイルスから離れた高収率細胞外小胞製剤の精製

Published: September 12, 2019
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Summary

このプロトコルは、EVの降水量、密度勾配超遠心分離、粒子捕捉を組み込むことにより、高効率で歩留まりのあるビリオンから離れた細胞外小胞(EV)を分離し、合理化されたワークフローと開始の削減を可能にします。すべてのEV研究で使用するための再現可能な準備をもたらす容積の条件。

Abstract

今日の細胞外小胞(EV)研究の分野における主要なハードルの1つは、ウイルス感染の設定で精製されたEV製剤を達成する能力です。提示された方法は、EVをバイリオン(すなわち、HIV-1)から分離することを意味し、従来の超遠心分離法と比較して、より高い効率と収率を可能にします。当社のプロトコルには、EVの降水量、密度勾配分離、粒子捕捉の3つのステップが含まれています。下流アッセイ(すなわち、ウェスタンブロット、およびPCR)は、粒子捕捉に続いて直接実行することができる。この方法は、最小限の開始ボリュームの使用を可能にする他の絶縁方法(すなわち、超遠心分離)よりも有利です。さらに、複数の超遠心分離ステップを必要とする代替EV分離方法よりもユーザーフレンドリーです。しかし、この方法は、当社の粒子から無傷のEVを溶出することは困難であるため、機能性EVアッセイの範囲に限られています。さらに、この方法は厳密に研究ベースの設定に合わせて調整され、商業的に実行可能ではありません。

Introduction

細胞外小胞(EV)を中心とした研究、特にエキソソームは、30〜120nmのEVの一種であり、CD81、CD9、CD63の3つのテトラスパニンマーカーの存在を特徴とし、主に分離する方法の開発によって形成されてきた。興味のある小胞を浄化する。多面的なメカニズムを解剖する能力は、幅広い内容、サイズ、および広い範囲の異なる経路を介して生成された小胞の異種集団からなるサンプルを生成する複雑で時間のかかる技術のために妨げられてきた。密度。これはほぼすべてのEV研究の課題ですが、ウイルスやウイルス様粒子(VLP)は対象の小胞と直径が似ているため、ウイルス感染の文脈でEVを研究する際に特に重要です。例えば、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)は直径約100nmで、多くのタイプのEVとほぼ同じ大きさです。このため、これらの問題に対処するための新しい EV 分離ワークフローを設計しました。

EV分離の現在のゴールドスタンダードは超遠心分離です。この技術は、様々な小胞密度を利用して、各段階1、2で、より高密度粒子と低密度粒子の差動堆積を伴う遠心分離によって小胞を分離することを可能にする。無傷の細胞(10分間300~400xg)、細胞破片(10分間は約2,000×g)、アポトーシス体/大小胞(10分間は約10,000 x g)を除去するには、いくつかの低速遠心分離ステップが必要です。これらの初期精製は、高速超遠心分離(1.5-2時間の100,000-200,000 x g)を堆積物EVに続きます。洗浄工程は、EVの純度をさらに確保するために行われるが、これにより絶縁されたEVの数が減少し、それによって総収量3、4を低下させる。この方法の有用性は、十分な結果を達成するために、多数のセル(約1 x 108)と大きなサンプル容積(> 100 mL)の要件によってさらに制限されます。

増大する懸念に対処するために、親水性ポリマーを用いた小胞の沈殿は、近年有用な技術となっている。ポリエチレングリコール(PEG)またはその他の関連する沈殿試薬は、ユーザーが選択した試薬でサンプルをインキュベートするだけでサンプル内の小胞、ウイルス、タンパク質またはタンパク質RNA凝集体をプルダウンし、その後に単一の低速を使用することができます。遠心分離1,2,5.我々は以前に、従来の超遠心分離と比較してEVを沈殿させるためにPEGまたは関連する方法を使用すると、著しく高い収率6をもたらすと報告しました。この戦略は、高速で簡単で、追加の高価な機器を必要とせず、容易にスケーラブルであり、EV構造を保持します。しかし、この方法の無差別な性質のために、得られたサンプルは、フリータンパク質、タンパク質複合体、EVの範囲、およびビリオンを含む様々な製品を含むので、所望の集団1を得るためにさらなる精製を必要とする。 278.

様々な降水法から得られるEVの不均一性を克服するために、密度勾配超遠心分離(DG)は、その密度に基づいて粒子をより良く分離するために利用される。この方法は、タンパク質、タンパク質複合体、ウイルスまたはウイルス様粒子(VLP)からのEVの分離を可能にする、iodixanolまたはショ糖などの密度勾配媒体を用いて段階的勾配を用いて行われる。DGはEV亜集団のより正確な分離を可能にすると考えられていたが、現在では様々な小胞の大きさと密度が重なり合うことが知られていることに注意することが重要である。例えば、エキソソームは1.08-1.22 g/mL9の浮入密度を持つことが知られており、ゴルジ(COPI+またはクラトリン+)から分離された小胞は1.05-1.12 g/mLの密度を持ち、子宮内膜網状(COPII+) 1.18-1.25 g/mL1、2、3、4、9堆積物。さらに、外染分分をウイルス粒子を含む画分と比較したい場合、目的のウイルスの密度に応じて、HIV-1以外のウイルスが同じで平衡化する可能性が高いウイルスが存在する可能性があります。外染陽性分画2としての密度。

最後に、下流の可視化と機能的アッセイのためのEV準備の充実は、EV研究に不可欠です。EV濃縮ナノ粒子、具体的には、直径700~800nmの多機能ヒドロゲル粒子の使用は、濃縮EVの準備を達成する上で重要なステップです。彼らは選択性を促進するために多孔質の外ふるい殻によって封入された高い親和性の芳香族餌を有する。本研究で利用されるナノ粒子には、様々な試薬や生体流体からのEVの捕捉を増加させる異なるコア餌(反応性赤120 NT80;チバクロンブルーF3GA NT82)を用いた2つの異なる調製物が含まれる(材料の表を参照)。 )6,10,11,12,13,14,15.この粒子は、iodixanol画分、細胞培養上清、血漿、血清、脳脊髄液(CSF)、尿6、尿などの患者の生体流体を含む多数の出発物質からEVを容易に濃縮します。.

ここで提示する方法は、いくつかの技術を組み合わせることによって、現在のEV浄化技術の効率を向上させる。EVの降水量、密度勾配超遠心分離、粒子捕捉により、ワークフローを合理化し、サンプル要件を低減し、歩留まりを高め、すべてのEV研究で使用するより均質なEVサンプルを得ることができます。この方法は、大きな不要な小胞とVLPを除外する0.22 μmの濾過ステップと、効果的に密度に基づくEV集団全体の分離を含むため、ウイルス感染時のEVおよびその内容の調査に特に有用である。EVをバイリオンから隔離する。

Protocol

1. 細胞外小胞(EV)の濾過と沈殿 感染またはトランスフェクトされた細胞(すなわち、細胞株および/または一次細胞)から培養上清を調製するために、適切な培養培地で37°Cおよび5%CO2で5日間の後期ログ細胞の約10mLを培養する(すなわち、10%の胎児ウシを用いたRPMIまたはDMEM)血清[FBS])。注:すべての培養培地試薬はEVを含んでおらず、90分間100,000 x gで血清を事前…

Representative Results

PEG沈殿はEVの歩留まりを増加させるEV分離への組み合わせアプローチは、従来の超遠心分離に比べてEV回収の面で大幅に効率的であり、必要な開始材料の量が90%減少することが明らかです。EV分離における現在のゴールドスタンダードである超遠心分離は、下流アッセイに十分なEV準備を行うために約100mLの培養上清を必要としますが、当社の新しいプロ?…

Discussion

この方法は、EVの歩留まりを高め、分離への組み合わせアプローチを使用してEVからウイルスを分離することを可能にします。比較的大量の出発物質(すなわち、細胞上清)は、沈殿、DG分離、ナノ粒子濃縮によるEV分離前に濾過することができ、最終的な体積は〜30 μLとなり、様々な中で即時使用が可能下流のアッセイ。ナノ粒子濃縮の使用は、従来の超遠心分離に比べて、これらのEV濃縮ナノ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

カシャンチ研究室の全メンバー、特にグウェン・コックスに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(NIH)助成金(AI078859、AI074410、AI127351-01、AI043894、NS099029)の支援を受けています。

Materials

CEM CD4+ Cells NIH AIDS Reagent Program 117 CEM
DPBS without Ca and Mg (1X) Quality Biological 114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer Systems Biosciences EXOMAX24A-1 PEG precipitation reagent
Exosome-Depleted FBS Thermo Fisher Scientific A2720801
Fetal Bovine Serum Peak Serum PS-FB3 Serum
HIV-1 infected U937 Cells NIH AIDS Reagent Program 165 U1
Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA Thermo Scientific 723-2520
Nanotrap (NT80) Ceres Nanosciences CN1030 Reactive Red 120 core
Nanotrap (NT82) Ceres Nanosciences CN2010 Cibacron Blue F3GA core
Optima XE-980 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma-Aldrich D1556-250mL Iodixanol
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 331362
Ultra-Clear Tube, 14x89mm Beckman Coulter 344059

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DeMarino, C., Barclay, R. A., Pleet, M. L., Pinto, D. O., Branscome, H., Paul, S., Lepene, B., El-Hage, N., Kashanchi, F. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (151), e59876, doi:10.3791/59876 (2019).

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