وصف الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) هو موضوع شائع في البحوث المترجمة. يصف هذا البروتوكول فحصًا شبه تلقائي للفلورة المناعية (IF) لتوصيف PD-L1 وتعداد CTCs في عينات المرضى من سرطان الرئة غير الصغيرة (NSCLC).
يتم إلقاء الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) المستمدة من الورم الأساسي في مجرى الدم أو الجهاز اللمفاوي. هذه الخلايا النادرة (1-10 خلايا لكل مل من الدم) تبرر سوء التكهن وترتبط بالبقاء على قيد الحياة بشكل عام أقصر في العديد من السرطانات (مثل الثدي والبروستاتا والقولون والمستقيم). حاليا، ومكافحة EpCAM المغلفة المغناطيسي حبة القائم على نظام التقاط CTC هو اختبار معيار الذهب المعتمدة من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) لتعداد CTCs في مجرى الدم. ويستند هذا الاختبار على استخدام الخرز المغناطيسي المغلفة مع علامات المضادة للEpCAM، والتي تستهدف على وجه التحديد الخلايا السرطانية الظهارية. وقد أوضحت العديد من الدراسات أن EpCAM ليست العلامة المثلى للكشف عن رابع كلوريد الكربون. في الواقع، CTCs هي مجموعة فرعية غير متجانسة من الخلايا السرطانية وقادرة على الخضوع لانتقال الظهارية إلى mesenchymal (EMT) المرتبطة الانتشار النقيلي والغزو. هذه CTCs قادرة على الحد من التعبير عن سطح الخلية علامة الظهارية EpCAM، في حين زيادة علامات mesenchymal مثل vimentin. ولمعالجة هذه العقبة التقنية، تم تطوير أساليب عزل أخرى تستند إلى الخصائص الفيزيائية للمراكز. تتيح التقنيات الميكروفلويدية اتباع نهج خالٍ من الملصقات لإثراء رابع كلوريد الكربون من عينات الدم الكاملة. تستخدم التكنولوجيا المرنة الحلزونية قوى السحب بالقصور الذاتي ودين مع التدفق المستمر في القنوات المنحنية التي يتم إنشاؤها داخل رقاقة microfluidic حلزونية. يتم فصل الخلايا على أساس الاختلافات في الحجم واللدونة بين خلايا الدم الطبيعية والخلايا السرطانية. يفصّل هذا البروتوكول الخطوات المختلفة لتوصيف التعبير المبرمج لـ ctcs عن الـ CTCs، الذي يجمع بين جهاز سائل صغير حلزوني مع مجموعة علامات الفلورة المناعية القابلة للتخصيص (IF).
تلعب الخلايا الليمفاوية T السامة للخلايا (CTLs) دورًا حاسمًا في الاستجابة للسرطانات من خلال عملية تعرف باسم “المراقبة المناعية” للسرطان. يتم تعزيز وظائفها المضادة للورم من قبل الأجسام المضادة حاجز نقطة التفتيش المناعية مثل مثبطات CTLA-4 ومثبطات PD-1/PD-L1. في سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة (NSCLC)، العلاجات المضادة للPD-1/PD-L1 تؤدي إلى معدلات استجابة تتراوح بين 0٪ -17٪ في المرضى الذين يعانون من الأورام السلبية PD-L1 و 36٪ -100٪ في تلك التي تعبر PD-L1. تظهر الاستجابات القوية لحصار PD-1/PD-L1 الذي لوحظ في الورم الميلانيني وNSCLC من خلال الأدلة على تحسن معدل الاستجابة الإجمالي (RR)، والفوائد السريرية الدائمة، والبقاء على قيد الحياة الخالي من التقدم (PFS). حاليا، العلاجات المضادة للPD1 هي معيار الرعاية في الخط الثاني NSCLC العلاج مع nivolumab بغض النظر عن التعبير PD-L1 ومع pembrolizumab في المرضى الذين يعبرون PD-L1 ≥ 1٪. في علاج الخط الأول، ومعيار الرعاية هو pembrolizumab وحدها في المرضى الذين يعانون من NSCLC التعبير PD-L1 ≥ 50٪ ويمكن تعزيزها يحتمل أن تكون مع العلاج الكيميائي (platin ودواء دوبلت اعتمادا على النوع الفرعي الأنسجة)1،2.
ومع ذلك، فإن مثل هذا النهج لإدارة المريض قابل للنقاش3، حيث أن تعبير PD-L1 في الخلايا السرطانية عن طريق الكيمياء المناعية (IHC) ربما ليس العلامة الحيوية المصاحبة الأكثر مثالية. أخرى مثل عبء طفرة الورم4 (TMB)، عدم استقرار الأقمار الصناعية الدقيقة (MSI)، و / أو ميكروبيوتا ربما تكون مثيرة للاهتمام في هذا الإعداد إما وحدها أو في تركيبة. ومن المعروف NSCLC أن تكون الأورام غير متجانسة، إما مكانيا (من موقع الورم إلى آخر واحد) أو زمنيا (من التشخيص إلى التكرار). المرضى الذين يعانون من NSCLC عادة ما تكون هشة، والخزعات الأنسجة الغازية المتكررة قد تكون مشكلة. في الواقع، يتراوح معدل إعادة خزعة في التقدم الأول من 46٪ -84٪ اعتمادا على سلسلة، وإعادة خزعة ناجحة (وهذا يعني مع التحليل النسيجي والجزيئي الكامل) يتراوح بين 33٪-75٪. وهذا يعني أن 25٪ -67٪ من المرضى لا يمكن الحصول على تحليل شامل لإعادة خزعة خلال التقدم الأول5،6،7،8.
وبالتالي فإن ظهور “الخزعات السائلة” قد ولّد حماساً كبيراً في هذا السياق الخاص، حيث أنه يمكّن من إعادة تقييم حاسمة للتغيرات الجزيئية أثناء تطور المرض من خلال فحص تعميم الحمض النووي الحر (cfDNA) المستمد من تعميم الخلايا السرطانية (CTCs). يتم تحرير هذه الخلايا الحية من الورم في مجرى الدم، حيث أنها تدور بحرية. على الرغم من عدم استخدامها بشكل روتيني، يبدو أن تحليل CTCs واعد للغاية في حالة التوصيف الجزيئي والفينوتي، والتكهن، والأهمية التنبؤية في سرطان الرئة (عنطريق DNAseq، RNAseq، ميرنا وتحليل البروتين). في الواقع، من المرجح أن تحتوي الـ CTCs على خصائص فينوتيبيك للمرض النشط بدلاً من العلامات الأولية (التي تم اكتشافها عند التشخيص). وعلاوة على ذلك، تتجاوز CTCs مشكلة عدم التجانس المكاني للأنسجة السرطانية، والتي قد تكون مشكلة حاسمة في الخزعات الصغيرة. وبالتالي، فإن تعبير PD-L1 على CTCs قد يلقي الضوء على الاختلافات المستمدة من استخدامه كعلامة بيولوجية تنبؤية باستخدام أنسجة الورم.
في الآونة الأخيرة، تم اختبار تعبير PD-L1 في CTCs من NSCLC. تقريبا جميع المرضى اختبار9 كانت PD-L1 إيجابية، مما يعقد تفسير النتيجة واستخدامها السريري. وبشكل عام، تم الكشف عن CTCs إيجابية PD-L1 في 69.4٪ من العينات من متوسط 4.5 خلايا / مل10. بعد بدء العلاج الإشعاعي، زادت نسبة CTCs إيجابية PD-L1 بشكل كبير، مما يشير إلى رفع تنظيم التعبير PD-L1 استجابة للإشعاع11. وبالتالي، يمكن استخدام تحليل CTCs PD-L1 لرصد التغيرات الديناميكية للورم والاستجابة المناعية، والتي قد تعكس الاستجابة للعلاج الكيميائي، والإشعاع، والعلاج المناعي المحتمل (IT).
وحتى الآن، تعتمد عزلة CTCs وتوصيف PD-L1 على أساليب مختلفة مثل التقاط أجهزة مكافحة الحصى المغناطيسية المغلفة بالخرز، والاختبار القائم على التخصيب، والاختبار القائم على الحجم12و13 من مركبات مكافحة الإرهاب. ومع ذلك، تم الكشف عن CTCs فقط في 45٪ -65٪ من المرضى الذين يعانون من NSCLC النقيلي، مما يحد من قدرتهم على توفير أي معلومات لأكثر من نصف المرضى NSCLC النقيلي. وبالإضافة إلى ذلك، كان عدد الـ CTC منخفضاً في معظم هذه الدراسات باستخدام النهج القائم على الحجم10. وعلاوة على ذلك، أدت هذه الطريقة إلى اختلافات مثل الكشف عن خلايا CD45 (-)/DAPI(+) مع “أنماط الأورام الخبيثة” في مجرى الدم من المتبرعين الأصحاء. وتبرز هذه الشواغل الحاجة إلى طريقة حساسة للغاية لجمع رابع كلوريد الكربون المرتبطة بالنمط الظاهري المناعي لخلايا CD45 (-) غير النمطية من الدم الكامل السليم باستخدام علامات حيوية إضافية للسرطان (أي TTF1، فيمنتين، EpCAM، وCD44) في NSCLC.
وبالتالي، قمنا بتقييم جهاز microfluidic دوامة يستخدم القصور الذاتي ودين سحب القوات لفصل الخلايا على أساس الحجم واللدونة من خلال رقاقة microfluidic. تشكيل تدفقات دوامة عميد موجودة في رقاقة microfluidic النتائج في CTCs أكبر تقع على طول الجدار الداخلي والخلايا المناعية أصغر على طول الجدار الخارجي للرقاقة. وتكتمل عملية التخصيب عن طريق سرقة الخلايا الأكبر حجما ً إلى منفذ التجميع كجزء من رابع كلوريد الكربون المخصب. هذه الطريقة حساسة ومحددة بشكل خاص (الكشف عن حوالي 1 CTC/مل من الدم كله)14 ويمكن أن تكون مرتبطة مع تحليلات الفلورة المناعية المخصصة (IF). وستمكن هذه الأدوات من وضع عتبة إيجابية للتفسير السريري. وهكذا يتم وصف سير العمل الذي يمكّن علماء الأحياء من عزل وخصائص CTCs ذات النمط المناعي المناعي بمعدل عال من الانتعاش والخصوصية. يصف البروتوكول الاستخدام الأمثل للجهاز الميكروفلويديك اللولبي لجمع CTCs، والاختبارات IF الأمثل التي يمكن تخصيصها وفقا لنوع السرطان، واستخدام البرمجيات الحرة مفتوحة المصدر لقياس وتحليل صور الخلايا لأداء شبه تلقائي حساب الخلايا وفقا لتلطيخ الفلورسنت. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تنفيذ تعدد الإرسال المجهر اعتمادا على عدد من مرشحات الفلورسنت / علامات المتاحة.
وقد أثيرت نقطتان رئيسيتان في هذه الدراسة، الأولى فيما يتعلق بأداء سير العمل لنقله إلى التطبيقات السريرية، والثانية تتعلق بانخفاض الذاتية لتحليل صور الفلورة التي تم الحصول عليها.
تم تحديد سير عمل أداء ومحسن لتعداد CTC في البداية باستخدام فحص IF للتخصيص بعد إثراء الخلية عن طري…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا العمل بمنح بحثية من أسترازينيكا (لندن، المملكة المتحدة)، وشركة بوليديكس (سنغافورة)، ورابطة مكافحة السرطان (سون ولوار، فرنسا). ويشكر المؤلفان شركتي أسترازينيكا وبيوليليكس على دعمهما المالي.
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4°C |
BD Facs Clean – 5L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4°C |
CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4°C |
CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
Coulter Clenz Cleaning Agent – 5L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4°C |
EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4°C |
Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4°C |
Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
Fungizone – 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4°C |
FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4°C |
Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4°C |
PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) – Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4°C |
Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4°C |
Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1X – 1L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4°C |
RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4°C |
Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4°C |
Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |