Summary

Isolação de pilhas epithelial salivares das glândulas salivares humanas para o crescimento in vitro como Salispheres ou monolayers

Published: July 15, 2019
doi:

Summary

Nós apresentamos um método para isolar e cultivar pilhas epithelial glândula-derivadas humanas preliminares do salivar. Estas pilhas exibem testes padrões da expressão de gene consistentes com eles que são da origem epithelial salivar e podem ser crescidos como salispheres em matrizes da membrana do porão derivadas das pilhas do tumor de engelbreth-Holm-enxame ou como monocamadas em pratos tratados da cultura.

Abstract

As glândulas salivares são um local de interesse significativo para os pesquisadores interessados em múltiplos aspectos da doença humana. Um objetivo dos investigadores é restaurar a função das glândulas danificadas por terapias de radiação ou devido às patologias associadas com Sjögren ‘ síndrome de s. Um segundo objetivo dos pesquisadores é definir os mecanismos pelos quais os vírus se replicam dentro do tecido glandular, onde eles podem então obter acesso aos fluidos salivares importantes para a transmissão horizontal. Esses objetivos destacam a necessidade de um modelo de glândula salivar robusta e acessível in vitro que possa ser utilizado por pesquisadores interessados nas áreas de pesquisa acima mencionadas, bem como relacionadas. Aqui nós discutimos um protocolo simples para isolar pilhas epithelial das glândulas salivares humanas e para propagá-las in vitro. Nosso protocolo pode ser otimizado para atender às necessidades de estudos individuais. Resumidamente, o tecido salivar é mecanicamente e enzimaticamente separado para isolar células individuais ou pequenos aglomerados de células. A seleção para pilhas epithelial ocorre chapeando em uma matriz da membrana do porão na presença dos meios aperfeiçoados para promover o crescimento epithelial da pilha. Estas culturas resultantes podem ser mantidas como aglomerados tridimensionais, denominados “salispheres”, ou cultivados como monocamada em pratos de cultura de tecidos plásticos tratados. Este protocolo resulta no crescimento de uma população heterogénea de células principalmente epiteliais que podem ser propagadas para 5-8 passagens (15-20 duagações populacionais) antes de se submeterem à senescência celular.

Introduction

Em mamíferos, as glândulas salivares são organizadas em 3 pares de glândulas salivares principais: as glândulas parótida, submandibular e sublingual. Existe também uma série de glândulas menores localizadas na língua e espalhadas por toda a cavidade oral1. As glândulas principais são responsáveis para o volume de maioria de saliva produziu2. Além de fornecer proteção antimicrobiana por meio de fatores secretados, a saliva é importante no processo de mastigação e lubrificação de alimentos à medida que passa pelo esôfago2. Como tal, a disfunção da glândula salivar representa um problema médico em que os doentes que são incapazes de produzir saliva suficiente são mais propensos a desenvolver doenças, como cavidades dentárias ou candidíase oral3. Adicionalmente, a redução da saliva resulta em maior dificuldade em comer e digerir os alimentos com um impacto significativo na qualidade de vida.

A disfunção da glândula salivar é encontrada principalmente em pacientes que sofrem de síndrome de Sjögren, uma desordem auto-imune, ou em pacientes com câncer de cabeça e pescoço que passaram por terapia de irradiação3,4,5, a 6. O ácinos secretora danificado dentro das glândulas em conseqüência da autoimunidade ou da terapia de radiação não se submete à autorenovação, que conduz a um paciente que vive com dano irreversível6. O estudo das glândulas salivares também tem ganhou a atenção ou pesquisadores interessados em mecanismos de patogênese viral. Alguns patógenos, como o citomegalovírus humano (HCMV), persistentemente replicam dentro das glândulas salivares, o que permite a transmissão do vírus nascente para um novo hospedeiro via saliva7,8. Assim, há uma necessidade não satisfeita de desenvolver modelos in vitro robustos e reprodutíveis do tecido da glândula salivar para abordar e compreender uma disposição diversa de problemas médicos.

Vários modelos do sistema de glândula salivar Murina têm sido utilizados como ponto de partida para compreender e caracterizar as diferentes células epiteliais que formam as glândulas salivares9,10. Existem diferenças óbvias e importantes entre as glândulas salivares humanas e murinas11. Mais notavelmente, a glândula parótida humana é maior em relação à glândula submandibular, enquanto o camundongo submandibular e a parótida são muito semelhantes no tamanho1,2,11. Quando as linhas de pilha submandibular humanas imortalizado existirem, há umas preocupações principais que as pilhas imortalized não mantêm exatamente o phenotype do tecido preliminar e das preocupações secundárias que as pilhas imortalized não são derivadas realmente do epitélio salivar próprio12. Por estas razões há um interesse e uma necessidade de estudar o tecido salivar preliminar dos seres humanos.

Aqui nós descrevemos um protocolo para isolar pilhas epithelial preliminares das glândulas salivares humanas para a cultura do tecido. Nosso protocolo é baseado nas obras de Pringle et al. e Tran et al. com modificações feitas para simplificar geralmente seus procedimentos13,14. Primeiro, enquanto o protocolo de Tran et al. exige uma longa incubação de cinco horas para digerir enzimaticamente o tecido salivar, nosso protocolo modificado tem sido bem-sucedido com pouco tempo de incubação de uma hora, semelhante ao de Pringle et al. Em segundo lugar, nós usamos enzimas diferentes para a digestão do tecido, o mais notàvelmente nós não usamos o tripsina como é usado no protocolo original de Tran et al., mas usamos uma mistura do Dispase e do Collagenase. Nós preferimos evitar o tripsina nas etapas iniciais da digestão como um estudo recente sugeriu que a digestão inicial do tecido salivar pela tripsina resulte na viabilidade reduzida da pilha, possivelmente pela perda de uma população rara da pilha de haste15. Por fim, nós cultive os salispheres na superfície da matriz da membrana do porão (BMM) usando meios comercialmente disponíveis originalmente formulados para a propagação de pilhas epithelial brônquicas. Nosso protocolo pode ser usado para isolar as células salivares das glândulas parótidas, submandibulares e sublinguais. Estas pilhas expressam a amilase salivar e outros genes específicos salivares que indicam que mantêm um phenotype similar àquele de pilhas epithelial acinar salivares7. Nós geramos com sucesso culturas salivares de > 50 amostras preliminares do tecido humano usando esta metodologia. Além disso, as pilhas salivares preliminares podem facilmente ser cryopreservado para o uso em uma data mais atrasada.

Protocol

Estes protocolos e estudos foram revistos e aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Cincinnati (Federal-Wide Assurance #00003152, protocolo IRB 2016-4183). O tecido salivar é geralmente resected em muitos procedimentos cirúrgicos da cabeça e da garganta e é geralmente não involvido pelo processo maligno. Tipicamente, o tecido da glândula salivar recentemente resected é usado dentro de 2-4 h após a remoção do paciente (Figura 1a). <p class="jove_titl…

Representative Results

Dois-três dias após o chapeamento de células de tecido digerido para BMM, as células prontamente formam pequenos clusters que continuarão a expandir em tamanho até 15-20 células por cluster (Figura 2a). Os restos celulares e as pilhas inoperantes destacadas são vistos tipicamente e devem ser removidos aspirando e reabastecendo com meios frescos. As células continuarão a proliferar como salispheres por cerca de 3-10 dias, ou contanto que a camada de …

Discussion

A disfunção salivar representa uma preocupação com a qualidade de vida para aqueles que sofrem de síndrome de Sjögren, bem como aqueles submetidos a radioterapia para cânceres adjacentes às glândulas salivares3,4,5, a 16. Uma terapia propor para tratar estes pacientes é crescer pilhas de haste salivares funcionais ou organóides in vitro, que podem então ser introduzidos na glândula…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a James P. Bridges por fornecer orientações significativas sobre as metodologias envolvidas na cultura das células primárias. Matthew J. Beucler foi apoiado pelos institutos nacionais de formação em saúde Grant T32-ES007250. Este trabalho também foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde concede R01-AI121028 e R21-DE026267 concedidos a William E. Miller.

Materials

100 mm culture dishes Thermo Scientific 172931
15 mL conical tubes Thermo Scientific 339651
50 mL conical tubes Thermo Scientific 339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media Lonza CC-3171 Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh Fisher 22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum Gibco 12676-029
Collagenase type III Worthington LS004182 Store at 4 °C.
Cryogenic Tube Fisher 5000-0020
Dispase Cell Applications 07923 Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors Fisher 08-940
Dulbecco phosphate buffered saline Corning 55-031-PC
General Chemicals Sigma
PathClear Basement membrane extract Cultrex 3432-005-01 Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes Falcon 353046
Surgical forceps Fisher 22-079-742
Trypsin-EDTA solution Corning 25-052-CI

References

  1. Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).
  2. Holmberg, K. V., Hoffman, M. P., Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. Monographs in Oral Science. 24, 1-13 (2014).
  3. Vissink, A., et al. Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).
  4. Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases. Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).
  5. Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. Ten-year observation of patients with primary Sjögren’s syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes. International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).
  6. Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review. Cancer. 107, 2525-2534 (2006).
  7. Morrison, K. M., et al. Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium. Journal of Virology. , (2018).
  8. Pomeroy, C., Englund, J. A. Cytomegalovirus: epidemiology and infection control. American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).
  9. Maimets, M., et al. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).
  10. Varghese, J. J., et al. Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells. Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).
  11. Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers. Oral Diseases. , (2018).
  12. Lin, L. C., et al. Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study. Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).
  13. Tran, S. D., et al. Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland. Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).
  14. Pringle, S., et al. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  15. Nam, H., et al. Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures. Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).
  16. Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).
  17. Cannon, M. J., et al. Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children. BMC Infect. Dis. 14, (2014).
  18. Pringle, S., et al. Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy. STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).
  19. Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).
  20. Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).
  21. Foraida, Z. I., et al. Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization. Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).

Play Video

Cite This Article
Beucler, M. J., Miller, W. E. Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers. J. Vis. Exp. (149), e59868, doi:10.3791/59868 (2019).

View Video