本文详细解释了评估大西洋鲑鱼微矿物可用性的系统方法。该方法包括生物复杂性日益提高的工具和模型:(1) 化学光谱分析,(2) 体外溶血性,(3) 细胞系吸收研究,(4) 活体鱼类研究。
评估膳食微矿物质的可得性是鱼类矿物营养的一大挑战。本文旨在描述一种系统的方法,结合不同的方法来评估大西洋鲑鱼(萨尔莫萨拉)中锌(Zn)的可用性。考虑到大西洋鲑鱼饲料中可能存在几个Zn化学物种,因此推测Zn的可用性受饲料中存在的Zn化学物种的影响。因此,在这项研究中,第一个协议是关于如何从饲料中提取不同的Zn化学物种,并通过大小排除色谱-感应耦合等离子体质谱(SEC-ICP-MS)方法分析它们。随后,开发了一种体外方法,以评估大西洋鲑鱼饲料中膳食Zn的溶解性。第三个协议描述了使用虹鱼肠道细胞系(RTgutGC)研究改变Zn化学物种成分对鱼肠道上皮模型中Zn吸收的影响的方法。将体外方法的发现与一项体内研究进行了比较,该研究检查了Zn补充大西洋鲑鱼饲料的无机和有机来源的明显可用性。结果表明,在饲料中可以发现几个Zn化学物种,有机Zn源的效率在很大程度上取决于用于溷合Zn的氨基酸配体。体外方法的发现与体内研究的结果相关性较小。然而,本文中描述的体外协议提供了有关 Zn 可用性及其在鱼类饲料中的评估的关键信息。
鱼粉和鱼油传统上用于大西洋鲑鱼饲料。然而,这些成分正越来越多地被植物性成分1所取代。上述饲料成分的改变导致饮食供应不足,对改善大西洋鲑鱼饲料,特别是锌(Zn)2的矿物供应的需求增加。可用性减少可能是 Zn 水平、Zn 化学物种或/和饲料基质中存在的抗营养因素发生变化的结果。在这种情况下,一系列被普遍视为”有机来源”的添加剂已经出现,有可能成为鱼类更好的膳食矿物质来源。因此,重要的是要了解基本的化学和生理学,以指导矿物及其鱼类来源的供应。锌是所有生物体的基本微量元素。Zn作为信号分子的作用在鱼4的准细胞和细胞内水平上都得到了描述。在大西洋鲑鱼中,Zn缺乏与骨骼异常和各种Zn金属酶5,6的活性降低有关。
这项研究描述了一种系统的方法来理解Zn的可用性,将其分类为四个不同的化学和生物复杂性的隔间。所涉及的方法分为四个部分,如图1:(1)利用大小排除色谱-感应耦合等离子体质谱(SEC-ICP-MS)方法7对大西洋鲑鱼饲料可溶性部分的Zn化学物种的评价:(2) 大西洋鲑鱼饲料中补充Zn的体外溶血性:(3) 评价Zn化学物种吸收体外肠道模型(RTgutGC)8:和 (4) 大西洋鲑鱼 (萨尔莫萨拉尔)9中 Zn 的明显可用性。类似的协议可以开发为水产养殖鱼类物种的营养感兴趣的其他矿物(例如锰、氦、铜)。
Zn的肠道吸收似乎受到Zn物种13的化学形式的影响。在这方面,使用本文中描述的协议,可以依次研究大西洋鲑鱼Zn”可用性”背后的化学和生物方面。
本研究报告了Zn规格分析方法的使用。SEC-ICP-MS方法提供了有关大西洋鲑鱼饲料可溶性部分的Zn化学物种分子量的定性数据。这是通过比较分子量校准标准(即甲状腺蛋白(660 kDa)、Zn/Cu超氧化物脱酶(32 kDa)、肌红蛋白(17 kDa)和维生素B12(1.36 kDa)的保留时间与Zn含峰值的保留时间来实现的。Zn 规格分析中发现的一个挑战是,由于缺乏分析标准,无法识别未知的 Zn 化学物种。在 SEC 中,分子的分离基于其大小相对于静止阶段的毛孔。原则上,较大的分子会跑得更快,先去拉,小分子会跑得慢,14号以后会变小。因此,每个Zn含有峰值可能含有几个具有相似分子量15的化合物。这也助长了识别未知Zn化学物种的挑战。此外,还测试了几个温和的萃取条件,以提取Zn。提取的 Zn 较低(+10%)。轻度萃取条件被应用,以保持Zn化学物种完好无损,但这可能已经损害了提取效率7。
在体外溶解性测定中,补充Zn(作为放射性同位素 65ZnCl2)的溶解度表明氨基酸,特别是异丁和赖氨酸,增加了Zn的溶解性(图5)。在模拟胃肠道条件下直接使用饲料样本进行体外溶解性检测是基于Zn光谱变化取决于pH值16的知识。然而,在胃肠道开始时的酸性条件,可能会导致一些不可逆转的规格变化(例如,ZnO->ZnCl2,在胃酸性条件下存在HCl)。然而,这里使用的Zn源是ZnSO4, 其溶质性通过介质中的氨基酸得到改善。下一个要回答的问题是,增加的溶解度能否转化为可用性?RTgutGC肠道细胞系用于研究这个问题。在动物的矿物营养方面,”可用性”一词很难定义,与动物(体内)相比,可以在细胞(体外)中进行差异调节。因此,在使用肠道细胞系进行体外评估时,使用了”吸收”一词。细胞系提供了关于肠道上皮的Zn吸收机制的有用信息,这是控制动物矿物供应的复杂监管过程的一部分。RTgutGC细胞在氨基酸(即甲氨基氨酸)的存在下,为Zn的吸收培养了更好的能力; 图6)。然而,大西洋鲑鱼的无机和有机Zn来源之间在体内的明显可用性没有显著差异。在活体可用性研究中,Zn源比较是在饮食Zn水平远远超过已知的Zn要求大西洋鲑鱼17,总Zn浓度150毫克/公斤饲料。当测试的饮食水平在动物达到饱和之前处于线性动态范围内时,可用性的差异会更好地可视化。在目前的体内研究中,大西洋鲑鱼可能饱和,以观察到所用来源之间Zn吸收的差异。
总之,第一种方法提供了关于大西洋鲑鱼饲料可溶性部分中发现的不同Zn化学物种的定性信息:第二种方法,在氨基酸配体的存在下,补充Zn的体外溶血性得到改善:第三种方法证实,氨基酸改善溶血性可改善肠道上皮的吸收:相反,第四种方法未能发现Zn从无机或有机来源到大西洋鲑鱼的可用性差异。最后,虽然与体内发现不一致,但体外协议确实为理解 Zn 可用性的不同组件提供了有趣的见解。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是在挪威研究理事会资助的APREMIA项目(大西洋鲑鱼矿物的明显供应和需求,第244490号赠款)下进行的。
0.45 µm syringe filter | Sartorius | ||
0.45 μm membrane filter | Pall | ||
10 % fetal bovine serum | Eurobio | ||
1282 Compugamma Laboratory Gamma Counter | LKB Wallac | ||
24 well plates (Falcon, TPP microplates) | Thermo Fisher Scientific | 10048760 | |
2-aminobicyclo(2.2.1)heptane-2-carboxylic acid | Sigma Aldrich | A7902 | |
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks) | TPP Techno Plastic Products AG | 90075 | |
L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
Bradford assay kit | Bio-Rad | 5000001 | |
Centrifuge | Eppendorf Centrifuge 5702 | ||
L-Cysteine | Sigma Aldrich | 30089 | |
DL-methionine | Alfa Aesar | 59-51-8 | |
D-methionine | Sigma Aldrich | M9375 | |
Experimental fish feeds | Skretting | ||
Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
Guard column, TSKgel SWxl Type (7 μm particle size) | Tosoh | ||
L-Histidine | Sigma Aldrich | 53319 | |
HPLC coupled with a 7500ce ICP-MS | Agilent Technologies | ||
Hydrochloric acid | Emsure ACS, ISO, 37% w/w, Merck | 1.00317 | |
Knife mill | GM 300, Retsch Gmbh | ||
L-15 medium | Invitrogen/Gibco | 21083027 | |
L-methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
L-Lysine | Sigma Aldrich | 23128 | |
Methanol | LiChrosolv, HPLC grade, Merck | 1.06035 | |
Milli-Q water (18.2 MΩ cm) | EMD Millipore Corporation | ||
Myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
NexION 350D ICP-MS | Perkin Elmer | ||
Pasteur pipette | VWR | ||
pH meter | inoLab | ||
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | 806552 | |
RTgutGC cells | Obtained in kind from Professor Dr. Kristin Schirmer, Dept. of Environmental Toxicology, Eawag, Swiss Federal Institute of Aquatic Science and Technology, Switzerland | ||
SEC column, TSKgel G3000SWxl | Tosoh | ||
Sieve stainless steel (850 μm – 1.12 mm) | Retsch | ||
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | 436143 | |
Superoxide dismutase | Sigma Aldrich | S7571 | |
Thyroglobulin | Sigma Aldrich | T1001 | |
Tricaine methanesulphonate | PharmaQ | ||
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
Trypsin in 0.25% in phosphate-buffer saline | Biowest | L0910 | |
Versene EDTA solution | Invitrogen/Gibco | 15040-033 | |
Vitamin B12 | Sigma Aldrich | V2876 | |
Zinc chelate of glycine | Phytobiotics | ||
Zinc sulphate | Vilomix |