在这里,我们提出一个协议,以检测肿瘤体突变在循环DNA存在于患者生物流体(生物流体)。我们的滴数字聚合酶链反应(dPCR)方法能够定量肿瘤突变等位基因频率(MAF),促进对肿瘤反应的诊断和时间监测的微创补充。
与前期和重复手术组织取样相关的并发症显示,需要能够对肿瘤治疗反应进行分子分分类和时间监测的微创平台。在这里,我们描述了我们基于dPCR的方法,用于检测细胞自由DNA(cfDNA)中的肿瘤体突变,在患者生物流体中随时可用。尽管每次测定中可测试的突变数量有限,但这种方法提供了高水平的灵敏度和特异性。监测突变丰度,根据MAF计算,允许评估肿瘤对治疗的反应,从而提供放射成像急需的补充。
由于用于分子分析的肿瘤组织可用性有限,需要开发能够检测患者生物液体(包括血浆、血清和脑脊液 (CSF) 中的肿瘤体细胞突变的高度敏感方法.例如,小儿扩散中线胶质瘤 (DmG) 由于其神经解剖学位置而构成挑战。在过去的十年中,DMG组织标本的分子分析发现了该肿瘤类型1的驱动因素突变,并揭示了突变的空间和时间异质性,使得活检对疾病中患者的特征是必要的亚群和促进分子靶向疗法2。因此,临床试验提倡在前期诊断3、4、5、6中整合肿瘤分子分析的外科活检。在治疗过程中,DLG治疗反应的监测仅限于MRI,MRI缺乏检测小变化或肿瘤基因组进化的敏感性。MRI也容易检测伪进展,瞬时炎症在肿瘤的部位,模仿真正的进展成像,并可能错误地解释肿瘤反应7。因此,DPG 代表一种肿瘤类型,对检测肿瘤突变和监测临床反应的替代微创方法的需求很高。为了满足这些需求,我们开发并优化了一种方案,用于检测和量化中线胶质瘤8儿童血浆、血清和CSF中cfDNA突变的等位基因。鉴于儿童期 DLG 经常 (>80%)在组蛋白变体 H3.1(H3.1K27M,20% 的病例)或 H3.3(H3.3K27M,60% 的病例)位置 27 处携带体性以酶对蛋氨酸突变 1,这些和 DMC 的具有其他突变特征(即ACVR1、PIK3R1)的目标使用cfDNA8进行突变等位基因定量。此测定可定制,使用序列特定的引种和探针检测其他肿瘤类型的热点突变。这种方法的多功能性使其适用于各种癌症,这些癌症将受益于基于cfDNA的诊断工具和治疗监测的集成。
为了灵敏地检测cfDNA中的低等位基因突变,我们采用了基于滴数字PCR(dPCR)的方法。在这种方法中,PCR反应混合物使用dPCR平台(例如RainDance)被分割成理论最大值为1000万个液滴,每个PCR通常有700万至900万个液滴。由于样品分割程度高,每个滴中最多只能存在一到两个DNA分子。PCR扩增和序列特异性荧光探针杂交可发生在每个滴中,因此发生数百万次反应。这最大限度地提高了灵敏度,并能够检测稀有的突变等位子,否则在野生型DNA背景下可能无法检测到。利用锁定核酸(LNA)探针,通过限制不匹配杂交和支持9、10、11的准确突变检测,提高了测定的特异性。在这里,我们描述了我们的样品处理方法,cfDNA提取,目标等位子的预扩增,dPCR和数据分析。
在这里,我们介绍了从患者液体活检中检测和量化cfDNA中肿瘤突变的等位频率的方法。我们强调该方法成功的关键步骤,包括分析前样品处理、cfDNA提取、PCR 测定设计和数据分析。为了限制使用的样品体积,从1 mL的血浆中提取cfDNA,但仅提取500μL的CSF。从CSF中提取时,根据制造商的建议,使用从1 mL尿液中提取的协议(遵循cfDNA提取试剂盒手册12)。血浆和CSF之间所需的样本量差异是由于血浆中肿瘤特异性cfDNA水平低于脑肿瘤患者的CSF,因此突变检测所需的样本量较大。如果样品可用,可以从中提取超过1 mL的血浆,以产生更高的DNA产量。然而,对于小儿患者,尽可能减少使用的血液量很重要,因为即使是简单的程序,如抽血,对接受放射治疗的癌症的儿科患者来说也是很肥的。从1 mL等分血浆中提取也能够进行复制提取,这样测定可以重复(例如,在DNA提取失败或样品污染的情况下)。
为了减少任何并非绝对必要的样品使用,cfDNA 通常不量化。然而,我们在等离子体和CSF中分别发现0.2-2纳克/μL和0.6-13纳克/μL之间的cfDNA浓度范围。鉴于cfDNA的含量较低,并且肿瘤特异性突变位命在低频下存在,因此有必要使用用于dPCR的相同引物集进行预扩增步骤,以显著增加样品中靶DNA的含量,从而有助于突变检测8。在DNA悬浮液中稀释预扩增产物为技术复制提供了足够的体积,有助于区分真正的阳性。由于突变液滴的数量可能较低(例如,在血浆样本中的 0-2 个突变液滴之间),因此包含技术复制是解决突变状态的关键。虽然一个PCR孔可能产生0突变液滴,但另外两个可能产生1-2为单一血浆样品分析三元;因此,在确定突变状态时,包含复制可以提高准确性。然后,将 MAF 计算为复制值的平均值。
多路复用预扩增(预扩增野生型和两个感兴趣的突变突变等位基因)增加了单个样本的效用,因为相同的起始材料可用于测试两个突变。重要的是,多路复用预扩前产品可以在dPCR期间在单丛中进行分析,以便更加简单,如此处所述。但是,预扩介 PCR 和 dPCR 都可以多路复用。多路复用时,必须针对两组引水器和探头优化条件:引水退火温度必须类似于 PCR 放大时一起运行,并且探头应设计为生成不同的聚类(基于荧光信号和强度)。验证一组新的引体和探头时,运行退火温度梯度,以根据制造商建议的范围确定最佳退火温度。在测试患者 cfDNA 标本的探针之前,使用合成 DNA 构造和/或不同输入的肿瘤组织 gDNA(即高达 10 ng)进行验证。
为了检测在探针与目标DNA杂交中具有更大特异性和减少不匹配的突变等位子,使用锁定核酸(LNA)探针。LNA是一种核酸模拟体,带有一个亚甲桥,连接核糖环9的2’氧和4′碳。亚甲桥将核酸锁定成刚性双环形,从而限制灵活性,提高热双工稳定性,提高探针杂交的特异性,以靶向DNA 10,18,19.如果LNA探针和模板DNA之间存在单基不匹配,探头和目标之间的双面形成将不稳定。因此,LNA探头提高了探头结合的特异性,并产生了更高的信噪比11。对非CNS病患儿患者血浆和CSF的分析确定了我们针对H3F3A p.K27M的LNA探针的测定的特异性,以确定等于或小于0.001%的等位频率被认为是假阳性8.有关优化探头和引物设计的其他注意事项,包括 GC 含量、放大素大小、探针报子染料和淬火,请参阅 dPCR 制造商指南 14、17 。尽管我们的方法针对 RainDance 系统进行了优化,但该协议可以适用于其他 dPCR 平台。
这里介绍的方法从dPCR实现的高灵敏度和目标富集中汲取了力量,而dPCR仍然是检测cfDNA中罕见肿瘤突变的首选平台。dPCR虽然功能强大,但可在单次检测中测试的突变数量有限。dPCR 的替代方案是下一代测序 (NGS),它可检测多个基因的多个突变,从而增加单个样本的效用。NGS可以检测脑干胶质瘤20患者的CSF和血浆突变,然而,目前在检测cfDNA中的肿瘤突变方面比dPCR敏感,检测限值为0.1-10%MAF,而基于PCR的方法为0.001%.dPCR 还实现了比 NGS 更快的周转时间,从而能够快速检测感兴趣的突变。PCR方法适用于癌症类型,可扩展以检测热点突变和甲基化cfDNA22。
液体活检确实处于初级阶段,需要进一步开发,以适应特定的疾病。肿瘤进化背景下的肿瘤监测将是下一个挑战,需要一个能够检测高灵敏度的新兴突变的平台。此外,能够检测各种生物分子(肽、细胞因子、RNA)的平台将非常有益于评估肿瘤对治疗的反应,以及推进个性化的临床干预。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢所有病人及其家属的慷慨。这项工作得到了粉碎核桃基金会(弗吉尼亚州米德尔堡)、V基金会(亚特兰大,佐治亚州)、加布里埃拉·米勒儿童第一数据中心、国家儿童临床和转化科学研究所(加利福尼亚州)的资助。5UL1TR001876-03),穆塞拉基金会(纽约州休利特),马修·拉森基金会(新泽西州弗兰克林湖),利拉比恩小儿脑癌研究基金会(银泉,MD),儿童脑肿瘤基金会(德国城,马里兰州),儿童脑肿瘤组织联盟(费城,宾夕法尼亚州)和儿童癌症研究拉力赛基金会(佐治亚州亚特兰大)。
10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) | Teknova | T0227 | |
BD Vacutainer K2-EDTA 7.2mg Blood Collection Tubes (10mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367525 | For plasma collection |
BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367895 | For serum collection |
Bleach | General Lab Supplier | ||
Buffer ATL | Qiagen | 19076 | |
Cell-Free DNA Blood Collection Tubes | Streck | 218961 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
CentriVap Concentrator | Labconco | 7810010 | |
Forward Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
MiniAmp Thermal Cycler | Thermofisher Scientific | A37834 | |
Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) | General Lab Supplier | ||
Mutant Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
PAXgene Blood ccfDNA tubes | PreAnalytiX | 768115 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
PCR 8 well strip tube caps | VWR | 10011-786 | |
PCR 8 well strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | |
Pipette (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
Pipette filter tips (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs Inc | M0494S | |
QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook | Qiagen | cfDNA extraction kit handbook (2013 edition) | |
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) |
QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | Optional kit for DNA extraction from small (< or =200µL) sample volumes |
Qiavac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit |
Raindance Consumable Kit | Bio-Rad | 20-04411 | Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil |
Raindance Sense Instrument | Bio-Rad | Quantification instrument (used in Protocol Step 9) | |
Raindance Source Instrument | Bio-Rad | Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9) | |
RainDrop Analyst II Software | RainDance Technologies | Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10) | |
Refrigerated Vapor Trap | Savant | RVT5105-115 | |
Reverse Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
Smartblock 2mL | Eppendorf | 05 412 506 | |
TaqMan Genotyping Master Mix | Thermofisher Scientific | 4371353 | |
Thermomixer C | Eppendorf | 14 285 562PM | |
WT Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design |