Summary

Hibridação in situ da fluorescência quantitativa (peixes) e immunofluorescence (se) de produtos específicos do gene em pilhas KSHV-infectadas

Published: August 27, 2019
doi:

Summary

Nós descrevemos um protocolo que utiliza a hibridação in situ da fluorescência (peixes) para visualizar RNAs herpética múltiplas dentro das pilhas humanas liticamente contaminadas, na suspensão ou no aderente. Este protocolo inclui a quantificação da fluorescência produzindo uma relação Mimivírus e pode ser estendido para o visualização simultâneo do anfitrião e das proteínas virais com imunofluorescência (se).

Abstract

A introspecção mechanistic chega do estudo cuidadoso e da quantificação de RNAs e de proteínas específicos. As posições relativas destas biomoléculas durante todo a pilha em épocas específicas podem ser capturadas com a hibridação in situ da fluorescência (peixes) e a imunofluorescência (se). Durante a infecção por herpesvírus lítico, o vírus seqüestra a célula hospedeira para expressar preferencialmente genes virais, causando alterações na morfologia celular e no comportamento das biomoléculas. As atividades líticas são centradas em fábricas nucleares, denominadas compartimentos de replicação viral, que são perceptível apenas com FISH e IF. Aqui nós descrevemos um protocolo adaptável de peixes do RNA e se as técnicas para Kaposi ‘ s sarcoma-associou o Herpesvirus (KSHV)-pilhas infectadas, aderente e na suspensão. O método inclui etapas para o desenvolvimento de oligonucleotides antisense específicos, peixes dobro do RNA, peixes do RNA com se, e cálculos quantitativos de intensidades da fluorescência. Este protocolo foi aplicado com sucesso aos tipos múltiplos da pilha, às pilhas não infectadas, às pilhas latentes, às pilhas Lytic, aos tempo-cursos, e às pilhas tratadas com os nervos inibidores para analisar as atividades armazenamento de RNAs e de proteínas específicas do anfitrião humano e KSHV.

Introduction

Em sua fase lítica (ativa), os herpesvírus sequestram a célula hospedeira, causando alterações na morfologia celular e localização de moléculas biológicas, para produzir virions. A base das operações é o núcleo, onde o genoma viral do DNA duplo-encalhado é replicado e empacotado em um escudo da proteína, chamado um capsídeo1. Para começar, o vírus expressa suas próprias proteínas, seqüestro máquinas hospedeiras e impedindo a expressão de genes de acolhimento não essenciais, um processo denominado o efeito de desligamento do hospedeiro. A maioria desta atividade é localizada a 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-regiões nucleares livres chamadas compartimentos virais da replicação, compreendidos das proteínas do anfitrião e do viral, do RNAs, e do ADN viral2. A célula é revisado para fornecer espaço e recursos para os compartimentos de replicação e, portanto, montagem de capsids virais. Uma vez que o capsídeo sai do núcleo, como o capsídeo é envolvido no citoplasma para produzir uma partícula viral ligada à membrana, também conhecida como um virion, não é clara. A compreensão da localização e dos deslocamentos espaciais de ambos os hospedeiros e biomoléculas virais durante a fase lítica fornece uma introspecção mecanicista mais profunda no arranjo do compartimento da duplicação, do efeito do desligamento do anfitrião, da via do virion-saída, e do outro processos relacionados à infecção herpética e à replicação.

Atualmente, o melhor método para detectar e estudar essas alterações é a visualização de proteínas e RNAs em células infectadas com imunofluorescência (IF) e hibridação in situ fluorescente (FISH), respectivamente. O uso de um curso de tempo com essas técnicas revela a localização de biomoléculas em pontos-chave da fase lítica ou simplesmente, dados espaciotemporais. FISH e IF complementam outras técnicas bioquímicas, como a inibição de um processo celular (por exemplo, inibição da replicação viral do DNA), RT-qPCR (reação em cadeia da polimerase em tempo real), sequenciamento de RNA, manchas do Norte, espectrometria de massas, western blotting e análise da produção de DNA viral, que pode fornecer uma imagem mais global das atividades celulares.

Nós desenvolvemos estratégias do RNA Fish para examinar os produtos do RNA dos genes específicos e uma análise computacional que calcule quantitativamente a relação Mimivírus de um produto específico do gene. A preparação da amostra, modificada a partir de publicações anteriores por Steitz e colegas3,4, érelativamente fácil e pode ser usada tanto para as células aderentes como as suspensas. O protocolo também é adaptável para o uso simultâneo de múltiplas estratégias de RNA Fish (duplo RNA FISH) ou RNA FISH com estratégias IF. O desenvolvimento de uma estratégia específica de FISH é desafiador, mas as sugestões para melhorar o sucesso são delineadas. A análise de dados descrita aqui é quantitativa se os grânulos fluorescentes e os marcadores fortes de limites do compartimento são usados e oferecem a introspecção adicional nas micrografias, introspecção que remove o viés da observação. O protocolo detalhado é projetado para as pilhas latentes e Lytic contaminadas por Kaposi ‘ o Herpesvirus sarcoma-associado de s (KSHV) e pode ser usado com as pilhas ou as pilhas não contaminadas por outros Herpesvirus5. Os métodos de quantificação são aplicáveis a estudos sobre turnos nucleocitímicos ou relocalização entre compartimentos subcelulares na maioria das células.

Protocol

1. projeto de oligonucleotídeos antisense in situ da fluorescência (peixes) para detectar um transcrito herpética específico Selecione 25 a 40 segmentos do NT da seqüência do RNA do interesse e converta-o para ser antisense. Uma estratégia bem sucedida dos peixes pode conter de um até dez ou mais oligonucleotides antisense diferentes. Ao selecionar sequências, considere o seguinte: Se o RNA do interesse contem uma região original da repetição, a seguir capitalizar nesta característica e pro…

Representative Results

Os métodos FISH e IF detalhados neste manuscrito são mostrados na Figura 1 , juntamente com a quantificação dos resultados por traços de linha de intensidade fluorescente. Os resultados aqui apresentados são semiquantitativos e oferecem insight sobre a localização, em vez de comparações entre intensidades de diferentes manchas fluorescentes, pois experimentos não incluem um cordão fluorescente na preparação da lâmina. A Fig…

Discussion

O protocolo descrito neste relatório pode ser adaptado aos tipos diferentes da pilha e inclui etapas para peixes dobro do RNA e peixes do RNA com o se que usa anticorpos preliminares monoclonais e polyclonal. Embora as corrediças preparadas sejam imaged tipicamente com um microscópio confocal, a imagem latente pode ser executada com um microscópio de STED (depleção de emissão estimulada) após modificações da concentração aumentada do anticorpo e de um meio de montagem diferente. Para análise aprimorada de c?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski e Johanna B. Withers para aconselhamento sobre análise de dados. Agradecemos também ao G. Hayward pelo anticorpo anti-SSB. Este trabalho foi apoiado por subsídios T32GM007223 e T32AI055403 dos institutos nacionais de saúde (TKV) e concessão de NIH (CA16038) (para JAS). JAS é um investigador do Howard Hughes Medical Institute. As figuras 1-3 e a tabela 1 foram reproduzidas com a permissão da sociedade americana para microbiologia uma licença Creative Commons Attribution da seguinte publicação: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi ‘ s sarcoma-Associated A acumulação de mRNA do Herpesvirus em focos nucleares é influenciada pela replicação viral do ADN e pelo RNA nuclear Polyadenylated noncoding viral. Jornal de Virology. 92 (13), doi: 10.1128/jvi. 00220-18, (2018).

Materials

AlexaFluor594-5-dUTP Life Technologies C1100
anti-DIG FITC  Jackson Lab Immunologicals 200-092-156
Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody Invitrogen A-11037 Goat
Anti-SSB Antibody N/A N/A Ref. Chiou et al. 2002
BLASTn NIH NCBI N/A Free Sequence Alignment Software
Dextran Sulfate Sigma Aldrich D8906 Molecular Biology Grade
DIG-Oligonucleotide Tailing Kit Sigma Roche #03353583910 2nd Gen
Eight-Chamber Slides Nunc Lab Tek II #154453 Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. 
Formamide Sigma Aldrich F9037 Molecular Biology Grade
GAPDH Probes Stellaris SMF-2019-1 Compatible with protocol, Quasar 670
ImageJ  NIH, Bethesda, MD N/A Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/]
OligoAnalyzer IDT N/A Free Oligonucleotide Analyzer 
pcDNA3 Invitrogen A-150228
pmaxGFP Amaxa VDF-1012
Poly L-Lysine Sigma Aldrich P8920
Terminal Transferase Sigma Roche #003333574001
Vanadyl Ribonucleoside Complexes  NEB S1402S
Vectashield Vector Laboratories, Inc.  H-1000 DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. 

References

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Cite This Article
Vallery, T. K., Steitz, J. A. Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells. J. Vis. Exp. (150), e59697, doi:10.3791/59697 (2019).

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