Hier presenteren we een geïntegreerde workflow om fenotypische en moleculaire kenmerken te identificeren die circulerende tumorcellen (CTCs) karakteriseren. Wij combineren levende immunokleuring en robotachtige micromanipulatie van enige en geclusterde CTCs met enige cel-gebaseerde technieken voor stroomafwaartse analyse en beoordeling van metastasen-zaait capaciteit.
Blood-Borne metastase is verantwoordelijk voor de meeste kanker-gerelateerde sterfgevallen en impliceert circulerende tumorcellen (CTCs) die succesvol zijn in het vestigen van nieuwe tumoren op verre locaties. CTCs zijn te vinden in de bloedbaan van patiënten als enkelvoudige cellen (enkele CTCs) of als multicellulaire aggregaten (CTC clusters en CTC-witte bloedcel clusters), met de laatste weergave van een hogere gemetastaseerde vermogen. Beyond opsomming, fenotypische en moleculaire analyse is buitengewoon belangrijk voor ontleden CTC biologie en om te identificeren van de kwetsbare kwetsbaarheden. Hier bieden we een gedetailleerde beschrijving van een workflow die CTC immunokleuring en micromanipulatie, ex vivo cultuur omvat om de proliferatie en overlevingsmogelijkheden van individuele cellen te beoordelen, en in vivo metastase-vorming assays. Daarnaast bieden wij een protocol om de dissociatie van CTC-clusters in individuele cellen en het onderzoek naar intra-cluster heterogeniteit te bereiken. Met deze benaderingen, bijvoorbeeld, we nauwkeurig kwantificeren overleving en proliferatie potentieel van enkele CTCs en individuele cellen binnen CTC clusters, leidt ons naar de observatie dat cellen in clusters weer te geven betere overleving en proliferatie in ex vivo culturen in vergelijking met single ctcs. globaal, biedt onze werkstroom een platform aan om de kenmerken van ctcs op het enige niveau van de cel te ontleden, dat naar de identificatie van metastase-relevante wegen en een beter begrip van CTC biologie streeft.
De klinische manifestatie van metastasen in verre organen vertegenwoordigt de laatste fase van de progressie van kanker en is goed voor meer dan 90% van de kanker-gerelateerde sterfgevallen1. De overgang van gelokaliseerde naar gemetastaseerde ziekte is een multi-step proces, vaak bemiddeld door circulerende tumorcellen (ctcs)2,3,4. Deze cellen worden vergoten van de primaire tumor in de bloedcirculatie en worden vervoerd naar verre organen, waar ze kunnen extravasate en vast te stellen gemetastaseerde laesies5,6. Hoewel de stevige tumors een vrij hoog aantal CTCs kunnen vrijgeven, zijn de meeste CTCs bestemd om te sterven, ten gevolge van hoge afschuifkrachten in omloop, anoikis-gemedieerde celdood, immune aanval of beperkte capaciteiten om aan een buitenlandse micro-omgeving7aan te passen. Daarom is het cruciaal om instrumenten vast te stellen die de dissectie van de moleculaire kenmerken van die CTCs die zijn begiftigd met metastasen-zaaien vermogen mogelijk te maken. Recente preklinische en klinische studies suggereren dat de aanwezigheid en kwantiteit van enkelvoudige ctcs en CTC-clusters wordt geassocieerd met een slechtere uitkomst bij patiënten met verschillende soorten vaste tumoren8,9,10 , 11 , 12 , 13 , 14 . CTC-clusters zijn groepen van twee of meer ctcs die aan elkaar zijn gekoppeld tijdens de circulatie en zijn efficiënter in het vormen van metastase in vergelijking met enkele ctcs3,15,16. De cellen binnen een cluster handhaven sterke cel-cel adhesie door desmosomes en adherens verbindingen, die kunnen helpen om anoikis17,18te overwinnen. Onlangs hebben we opgemerkt dat clustering van CTCs is gekoppeld aan hypomethylation van bindende sites voor de stam-en proliferatie-geassocieerde transcriptiefactoren, wat leidt tot een verhoogde vermogen om met succes te initiëren metastase19. CTC cluster dissociatie resulteert in het remodelleren van belangrijke bindende plaatsen, en bijgevolg, de afschaffing van hun gemetastaseerde potentieel19. Bovendien aan clusters van kankercellen, kan CTCs aan witte bloed cel (het vaakst neutrofielen) ook associëren om hoge proliferatie niveaus in omloop te handhaven en hun gemetastaseerde vermogen20te verhogen. Nochtans, wordt de biologie van CTCs begrepen slechts voor een deel en verscheidene vragen blijven open, met inbegrip van de onderliggende moleculaire eigenschappen en de kwetsbaarheden van enige en geclusterde cellen.
In de afgelopen jaren zijn verschillende strategieën vastgesteld die gebruik maken van cel-oppervlakte expressie patronen en fysische eigenschappen van ctcs voor hun isolement21,22,23,24, 25. antigeen-afhankelijke isolatie methoden vertrouwen meestal op de expressie van cel oppervlak epitheelcellen adhesie molecuul (EpCAM)26. Het het vaakst gebruikt en (momenteel) het enige door de FDA goedgekeurde platform voor CTC-opsomming, is het CellSearch systeem, dat gebaseerd is op een procedure in twee stappen om CTCs21te isoleren. In de eerste stap, worden de plasma componenten verwijderd door centrifugeren, terwijl CTCs met magnetische ferrofluids die aan anti-EpCAM antilichamen wordt gekoppeld worden gevangen. In de tweede stap, de CTC-verrijkte oplossing is gekleurd voor nucleated (DAPI-positieve) cellen die cytokeratine (CK)8,18,19, terwijl witte bloedcellen (WBC) worden geïdentificeerd met behulp van de pan-leukocyten marker CD45. Ten slotte, gevangen cellen worden geplaatst op een geïntegreerde screening platform en CTCs worden geïdentificeerd door de expressie van EpCAM, CKs, en DAPI terwijl ze negatief voor CD45. Hoewel dit wordt beschouwd als de gouden standaard voor CTC opsomming, downstream moleculaire analyse is uitdagend met deze technologie als gevolg van inherente beperkingen in CTC ophalen. Bovendien, gezien de isolatie-procedure, CellSearch kan het voordeel van de verrijking van CTCs met hogere EpCAM niveaus in vergelijking met CTCs met een lagere EpCAM expressie, als gevolg van bijvoorbeeld kanker heterogeniteit27 of downregulation van epitheel markeringen 28,29. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn antigeen-onafhankelijke technologieën voor de verrijking van CTCs ontstaan. Bijvoorbeeld, de CTC-iChip integreert hydrodynamica scheiding van nucleated cellen, met inbegrip van CTCs en WBC van de resterende bloedbestanddelen, gevolgd door een immunomagnetic uitputting van antilichaam-Tagged WBC, waardoor zuivering van ongecodeerde en levensvatbare CTCs in oplossing25. Bovendien, het feit dat de meeste ctcs zijn iets groter dan rode bloedcellen (RBCs) of WBC geleid tot de ontwikkeling van op maat gebaseerde CTC verrijking technologieën23,30 (bijv. de Parsortix systeem (hoek)), die gebruik maakt van een microvloeiende-gebaseerde technologie, bestaande uit een vernauwing kanaal over de separatie cassette, leidende cellen naar een Terminal gap van ofwel 10, 8, 6,5 of 4,5 µm (verschillende maten zijn beschikbaar, afhankelijk van de verwachte diameter van de doelgroep kankercellen). Het merendeel van de bloedcellen passeren de smalle kloof, terwijl CTCs te krijgen gevangen als gevolg van hun grootte (maar ook vanwege hun lagere vervorming) en zijn dus bewaard in de cassette. Het terugdraaien van de stroomrichting maakt het vrijgeven van gevangen CTCs, die in een levensvatbare staat en geschikt voor downstream-analyse. Onafhankelijk van de gekozen protocol voor CTC isolatie, echter, typische post-verrijking procedures nog steeds CTCs die worden gemengd met een relatief klein aantal RBCs en WBC, waardoor de analyse van pure single of bulk CTCs uitdagend. Om dit probleem aan te pakken, hebben we een workflow die CTC manipulatie mogelijk maakt zonder potentiële bias geïntroduceerd door bloedcellen contaminanten. De toevoeging van immunokleuring op voorhand, met variabele antilichaam-combinaties, onderscheidt CTCs van bloedcellen en maakt het zelfs mogelijk om CTC-subgroepen te identificeren met verschillende oppervlakte-marker expressieprofielen. Deze uiterst aanpasbare procedure kan vervolgens verder worden gecombineerd met specifieke downstream-toepassingen.
Hier beschrijven we een workflow die begint met een CTC-verrijkt product (verkregen met een CTC-verrijking technologie van keuze) en combineert verschillende benaderingen om inzicht te krijgen in de CTC biologie op single-cell resolutie. In een notendop, onze workflow maakt het mogelijk de identificatie van enkele CTCs, CTC clusters en CTC-WBC clusters door Live immunokleuring, gevolgd door single-cel micromanipulatie en downstream-analyse met behulp van ex vivo kweken protocollen, enkele cel sequenties, en in vivo metastase assays.
De moleculaire karakterisering van CTCs houdt de belofte om ons begrip van het gemetastaseerde proces te verbeteren en de ontwikkeling van nieuwe anti-metastase therapieën te begeleiden. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de protocollen die CTC-micromanipulatie en downstream-analyse mogelijk maken, met inbegrip van zowel enkele cel-gebaseerde Functionele assays, Genexpressieanalyse en in vivo transplantatie voor gemetastaseerde potentieel beoordeling20.
<p class="jove_…The authors have nothing to disclose.
Wij danken alle patiënten die bloed hebben gewonnen voor onze studie, evenals alle betrokken clinici en studie verpleegkundigen. Wij danken Jens Eberhardt, uwe Birke, en Dr. Katharina Uhlig van ALS Automated Lab Solutions GmbH voor continue ondersteuning. Wij danken alle leden van het aceto Lab voor feedback en discussies. Onderzoek in het aceto Lab wordt ondersteund door de Europese Onderzoeksraad, de Europese Unie, de Zwitserse National Science Foundation, de Swiss Cancer League, de Basel Cancer League, de twee kantons van Basel via de ETH Zürich, en de Universiteit van Basel.
Anti-human EpCAM-AF488 | Cell Signaling Technology | CST5198 | clone: VU1D9 |
1X DPBS | Invitrogen | 14190169 | no calcium, no magnisium |
6-wells Ultra-low attachment plate | Corning | 3471 | |
Anti-human CD45-BV605 | Biolegend | 304041 | clone: HI30 |
Anti-human EGFR-FITC | GeneTex | GTX11400 | clone: ICR10 |
Anti-human HER2-AF488 | Biolegend | 324410 | clone: 24D2 |
Anti-mouse CD45-BV605 | Biolegend | 103139 | clone: 30-F11 |
BD Vacutainer K2EDTA | BD | 366643 | for human blood collection |
Cell Celector | ALS | CC1001 | core unit |
CellD software | ALS | version 3.0 | |
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | |
Micro tube 1.3 mL K3EDTA | Sarstedt | 41.3395.005 | for mouse blood collection |
PCR tubes | Corning | PCR-02-L-C | |
RLT Plus | Quiagen | 1053393 | |
SUPERase In RNase Inhibitor | Thermo Fisher | AM2696 | 1 U/µL |