Summary

Entrega de anticuerpos en el cerebro murino a través de la entrega mejorada por convección

Published: July 18, 2019
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Summary

La administración mejorada por convección (CED) es un método que permite la entrega efectiva de terapias en el cerebro mediante la perfusión directa de grandes volúmenes de tejido. El procedimiento requiere el uso de catéteres y un procedimiento de inyección optimizado. Este protocolo describe una metodología para CED de un anticuerpo en un cerebro de ratón.

Abstract

La administración mejorada por convección (CED) es una técnica neuroquirúrgica que permite la perfusión efectiva de grandes volúmenes cerebrales utilizando un sistema de catéter. Este enfoque proporciona un método de administración seguro que pasa por alto la barrera hematoencefálica (BBB), permitiendo así el tratamiento con terapias con permeabilidad bBB deficiente o aquellos para los que no se desea la exposición sistémica, por ejemplo, debido a la toxicidad. CED requiere la optimización del diseño del catéter, el protocolo de inyección y las propiedades del infusato. Con este protocolo se describe cómo realizar CED de una solución que contiene hasta 20 g de un anticuerpo en los putamen caudados de ratones. Describe la preparación de catéteres escalonados, probarlos in vitro y realizar el CED en ratones utilizando un programa de inyección de rampa. El protocolo se puede ajustar fácilmente para otros volúmenes de perfusión y se puede utilizar para inyectar varios trazadores o sustancias farmacológicamente activas o inactivas, incluyendo quimioterapéuticas, citoquinas, partículas virales y liposomas.

Introduction

La barrera hematoencefálica (BBB) forma un borde semipermeable que separa el sistema nervioso central (SNC) de la circulación sanguínea. Sin embargo, llegar al SNC con terapias es necesario en el contexto de diversas enfermedades, como tumores cerebrales, enfermedad de Alzheimer (AD) o enfermedad de Parkinson (PD), entre otras1. Esto se vuelve importante en el desarrollo de nuevas terapias, especialmente si el fármaco probado presenta una permeabilidad bBB deficiente o su exposición sistémica puede conducir a toxicidad peligrosa1,2. Algunos de los anticuerpos clínicamente utilizados muestran ambas características. Una solución a este problema sería entregar las terapias directamente detrás de la BBB.

El parto mejorado por convección (CED) es una técnica neuroquirúrgica que permite la perfusión efectiva de grandes volúmenes cerebrales. Esto se logra mediante la instalación quirúrgica de uno o más catéteres en el área objetivo. Durante la aplicación del fármaco, se forma un gradiente de presión en la apertura del catéter, que se convierte en la fuerza motriz de la dispersión infusate en el tejido3,4. Por lo tanto, es la duración de la perfusióny no los coeficientes de difusión los que determinan el rango de perfusión 2,4,5. Esto proporciona una entrega uniforme del infusato en un volumen cerebral mucho mayor en comparación con los métodos de inyección intracerebral convencionales basados en difusión2,6. Al mismo tiempo, esta modalidad de parto tieneun menor riesgo de daño tisular 2. En consecuencia, el CED puede permitir la administración segura y eficaz de quimioterapia convencional para el tratamiento de tumores del SNC, así como la administración de agentes inmunomoduladores o anticuerpos agonistas y antagonistas en una multitud de otros trastornos del SNC2 ,7,8,9. CED se prueba actualmente en terapias de la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, así como glioma de alto grado2,7,8,10,11.

El diseño del catéter y el régimen de inyección se encuentran entre los factores más importantes que influyen en el resultado de CED 10,12,13,14,15,16. Además, requiere propiedades fisicoquímicas específicas del infusato, incluyendo el tamaño moderado de las partículas, una carga aniónica, y baja afinidad de tejido 10,17. Cada uno de estos parámetros tiene que ser potencialmente ajustado de acuerdo con las características histológicas de la región cerebral a apuntar2,10,17.

Aquí describimos la metodología para realizar CED de una solución de anticuerpos en el putamen caudado (estriado) de ratones. Además, el protocolo incluye la preparación de catéteres paso a paso en una configuración de laboratorio, probarlos in vitro y realizar el CED.

Hay múltiples diseños de catéteres disponibles en la literatura, diferenciándose por la forma de la cánula, los materiales utilizados y el número de aberturas del catéter12,15,18,19,20 ,21,22. Estamos utilizando un catéter paso a paso hecho de un capilar de sílice fusionada que sobresale 1 mm de una aguja de metal de extremo contundente. Este diseño de catéter se puede fabricar fácilmente en un laboratorio de investigación y reproduciblemente da buenos resultados de CED cuando se prueba in vitro con bloques de agarosa con parámetros físicos que se asemejan al parénquima cerebral in vivo23.

Además, implementamos un régimen de rampa para la entrega de 5 ml de infusate in vivo. En este protocolo, la velocidad de inyección se incrementa de 0,2 l/min a un máximo de 0,8 l/min, minimizando así las posibilidades de reflujo infusato a lo largo del catéter, así como el riesgo de daño tisular16. Usando este protocolo, hemos administrado con éxito ratones con hasta 20 g de anticuerpos en 5 l de PBS en el transcurso de 11 min 30 s.

El protocolo se puede ajustar fácilmente para otros volúmenes de perfusión o para inyectar varias otras sustancias, por ejemplo, quimioterapéuticas, citoquinas, partículas virales o liposomas2,10,14,18 ,22. En caso de usar infusato con propiedades fisicoquímicas drásticamente diferentes en comparación con una solución salina tamponada de fosfato (PBS) o líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) de anticuerpos, se recomiendan pasos de validación adicionales. Para el montaje del catéter, validación y CED, describimos todos los pasos usando un robot estereotáctico con una unidad de perforación e inyección montada en un marco estereotáctico regular. Este procedimiento también se puede realizar con un marco estereotáctico manual conectado a una bomba de microinfusión programable que puede conducir las microjeringas de vidrio descritas.

Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por la Oficina Veterinaria Cantonal Suiza bajo el número de licencia ZH246/15. 1. Preparación de los catéteres escalonados Preparación de un tubo de sílice fusionado para el paso del catéter Corte el capilar de sílice fusionado con un diámetro interior de 0,1 mm y un espesor de pared de tubo de 0,0325 mm a una longitud de 30 mm. Examine el tubo en busca de grietas y pulir los extremos …

Representative Results

Este protocolo permite la preparación de catéteres paso a paso (Figura1) para su uso en el procedimiento CED en un entorno de laboratorio. Con el fin de controlar los catéteres para detectar fugas, reflujo a lo largo del tracto de la aguja y obstrucción, recomendamos realizar inyecciones de un tinte, por ejemplo, solución azul trypan, en un bloque de agarosa. La Figura 3 representa una nube de vía sordo azul formando después de la inyección de 1 l a 0,5 …

Discussion

La administración mejorada por convección, o la infusión de fármacos mediada por presión en el cerebro, se propuso por primera vez a principios de 19903. Este enfoque promete la perfusión de grandes volúmenes cerebrales detrás de la barrera hematoencefálica de una manera controlada2. Sin embargo, hasta ahora, sólo se han realizado unos pocos ensayos clínicos utilizando este enfoque, en parte porque el CED en una configuración clínica ha demostrado ser técnicam…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Universidad de Zúrich (FK-15-057), la Novartis Foundation for medical-biological Research (16C231) y Swiss Cancer Research (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) a Johannes vom Berg y BRIDGE Proof of Concept (20B1-1 _177300) a Linda Schellhammer.

Materials

10 μL syringe Hamilton 7635-01
27 G blunt end needle Hamilton 7762-01
Agarose Promega V3121
Atipamezol Janssen
Bone wax Braun 1029754
Buprenorphine Indivior Schweiz AG
Carprofen Pfizer AG
Dental drill bits, steel, size ISO 009 Hager & Meisinger 1RF009
Ethanol 100% Reuss-Chemie AG 179-VL03K-/1
Fentanyl Helvepharm AG
FITC-Dextran, 2000 kDa Sigma Aldrich FD2000S
Flumazenil Labatec Pharma AG
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775-500ML
High viscosity cyanoacrylate glue Migros
Iodine solution Mundipharma
Medetomidin Orion Pharma AG
Microforge Narishige MF-900
Midazolam Roche Pharma AG
Ophthalmic ointment Bausch + Lomb Vitamin A Blache
PBS ThermoFischer Scientific 10010023
Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 Jackson Immuno
Scalpels Braun BB518
Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm Postnova Z-FSS-100165
Stereotactic frame for mice Stoelting 51615
Stereotactic robot Neurostar Drill and Injection Robot
Succrose Sigma Aldrich S0389-500G
Topical tissue adhesive Zoetis GLUture
Trypan blue ThermoFischer Scientific 15250061
Water Bichsel 1000004

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Cite This Article
Beffinger, M., Schellhammer, L., Pantelyushin, S., vom Berg, J. Delivery of Antibodies into the Murine Brain via Convection-enhanced Delivery. J. Vis. Exp. (149), e59675, doi:10.3791/59675 (2019).

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