Summary

نموذج قوي المستحثة التي يسببها اللثة Murine لتقييم العدلات عن طريق الفم

Published: January 21, 2020
doi:

Summary

تقدم هذه المقالة بروتوكولا لإنشاء نموذج التي يسببها الربط من التهاب اللثة murine التي تنطوي علي العديد من المتعفنة الفك العلوي ، مما ادي إلى مناطق أكبر من الانسجه اللثة المعنية والعظام للتحليل اللاحق ، فضلا عن انخفاض استخدام الحيوانية. ويرد أيضا وصف لتقنية لتقييم العدلات عن طريق الفم بطريقه مماثله للمواضيع البشرية.

Abstract

المزايا الرئيسية لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لامراض اللثة باستخدام نماذج murine هي انخفاض تكلفه الحيوانية ، ومجموعه من سلالات معدله وراثيا ، وعدد كبير من التحليلات التي يمكن اجراؤها علي حصاد الانسجه الرخوة والصلبة. غير ان العديد من هذه النظم يخضع لانتقادات اجرائيه. وكبديل لذلك ، يمكن استخدام نموذج الربط المستحث لامراض اللثة ، مدفوعا بالتطوير الموضعي والاحتفاظ بميكروبيوم الفموي الدقيق ، والذي يتم الحث عليه بسرعة ويمكن الاعتماد عليه نسبيا. لسوء الحظ ، يتم عزل المتغيرات من الربط المستحثة اللثة التركيب البروتوكول إلى مناطق التركيز من دواعم الأسنان وتخضع ليثبت تغير السابق لأوانه من الاربطه المثبتة. وهذا يقلل من كميه الانسجه المتاحة للتحليلات اللاحقة ويزيد من عدد الماشية المطلوبة للدراسة. يصف هذا البروتوكول التلاعبات الدقيقة المطلوبة لوضع الحروف المركبة المولي الموسعة مع تحسين الاحتفاظ واستخدام تقنيه شطف الرواية لاستعاده العدلات عن طريق الفم في الفئران مع نهج بديل يخفف من المذكورة أعلاه التحديات التقنية.

Introduction

مرض اللثة (PD) هو شرط العظم المرتبطة بالاعتلال المضيف كبيره والعبء الاقتصادي ، والذي يتجلى من التهاب اللثة وفقدان كل من مرفق الانسجه الرخوة والدعم العظمي للأسنان المتضررة1،2،3،4. وتخضع هذه العملية للتفاعلات بين الميكروبات الفموية والجهاز المناعي الفطري للمضيف. ويرتبط أيضا مع تفاقم الامراض التهابيه الجهازية الأخرى بما في ذلك مرض السكري, امراض القلب والاوعيه الدموية, والسرطان5,6,7,8. تاريخيا, كان الافتراض ان المرض PD يعتمد علي كميات كبيره من البكتيريا المحددة مثل البوررومناس اللثة9. ومع ذلك ، تشير الادله الاخيره إلى ان العنصر الميكروبي من PD هو توسط من قبل biofilm الأسنان. و بيوفيلم هو مجتمع منظم ومعقد من الكائنات المجهرية العديدة التي يمكن ان توجد في التكافلية الصحية والمدمرة dysbiotic الدول10,11. بيوفيلم عن طريق الفم عاده ما يتيح المقاومة للمضيف من خلال منع إنشاء بؤر البكتيريا المسببة للامراض ويعزز هيكل الانسجه اللثة المثالي ووظيفة من خلال تنظيم استجابه المناعي المضيف12,13. اضطرابات العلاقة التوازن بين الكائنات الحية المعلقة داخل تجويف الفم والجهاز المناعي المضيف قد يؤدي إلى تغييرات في التوازن الانسجه ، مما ادي إلى دسباقتريوز وتطوير السمات المميزة السريرية والشعاعية من PD5،10،12،13،14.

ومن المثير للاهتمام ، وإنشاء دسباقتريسيس عن طريق الفم ، في حين المطلوبة للشروع في PD ، ليست كافيه لدفع PD في جميع الافراد ، التملص نحو قدره الاستجابة المناعية المضيف لتخريب الانتقال من الجراثيم بين التكافلية والدول dysاحيائي15. هذا يسلط الضوء بشكل خاص علي الوسائل التي من خلالها التاثيرات PD واحده من الشخصيات الرائدة في الجهاز المناعي الفطري ، وهي الحبيبية الكرياتالسبع(pmn) ، أو العدلات ، من منظور المحلية والجهازية16،17.

في البشر ، يتم تجنيد PMNs من الدورة الدموية بمعدل ~ 2 × 106 خلايا/ساعة في الانسجه الضامة الصحية اللثة ، حيث هم السكان الكريات البيضاء المهيمنة. هنا ، يتم طردهم في وقت لاحق من التلم اللثة في تجويف الفم كعنصر من السائل كريفيكولار اللثة. في وجود PD ، يظهر العدلات داخل الدورة الدموية وتجويف الفم ، حيث تمتلك هذه الخلايا المستجيبة النمط الظاهري التهابي المفرط الذي يؤدي إلى تدمير المذكورة أعلاه من دواعم السن17،18،19،20،21،22. لذلك ، فهم دور PMNs في PD وغيرها من الظروف التهابيه الجهازية ذات اهميه قصوى.

وعلي الرغم من انه من المقبول علي نطاق واسع ان الامراض المزمنة ترتبط ارتباطا متبادلا بالشرطة العامة ، فان أليات الاساسيه لم يتم توضيحها بعد ، مما أسهم في صعوبات في أداره هذه الظروف الجهازية المرضية والتي يحتمل ان تكون مميته. نماذج الحيوانية التجريبية متعددة, كل مع مزايا فريدة من نوعها وعيوب, وقد استخدمت لدراسة الفيزيولوجيا المرضية من PD23,24. التركيز بشكل خاص علي نماذج murine ، وهناك مجموعه متنوعة من البروتوكولات التي من خلالها يتم تسهيل دراسة PD ؛ ومع ذلك ، فانها تمتلك العديد من العيوب التقنية والفسيولوجية25،26،27،28،29،30،31.

أولا ، يتطلب نموذج الماوس أنبوبي عن طريق الفم العديد من التطعيمات عن طريق الفم من مسببات الامراض اللثة البشرية لتوليد التهاب اللثة وفقدان العظام. بالاضافه إلى ذلك ، فانه عاده ما تسبقه فتره من العلاج بالمضادات الحيوية لتخريب النباتات الفموية المعلقة التي تمت25. هذا النموذج غالبا ما يتطلب التدريب المتخصصة لأداء بأمان gavage عن طريق الفم, يستخدم سوي جزء صغير من مسببات الامراض اللثة من ميكروبيوم الإنسان الأكثر تعقيدا, ويتطلب عده أشهر لتاسيس فقدان العظام السنخيه.

وعلي النقيض من ذلك ، تستخدم نماذج murine المستحثة كيميائيا التسليم عن طريق الفم من حمض السلفونيك trinitrobenzene (TNBS) أو الصوديوم كبريتات ديكسكان (مفاجات صيف دبي) ، وكلاء تستخدم عاده في إنشاء نماذج murine من التهاب القولون علي مدي فتره عده أشهر للحث علي فقدان العظام اللثة26. النماذج القائمة علي الخراج في الفم وخارج الفم متاحه ، والتي تنطوي علي القواطع murine والانسجه من ظهر فضلا عن calvarium ، علي التوالي. في نموذج الخراج السابق ، تدار عده حقن من البكتيريا ، وخلق الخراجات اللثة متعددة وندره فقدان العظام السنخيه ، والحد من استخدامها في دراسة PD. نماذج الخراج الاخيره هي أكثر بكثير عرضه لدراسة ضراوة البكتيرية ، والتهاب ، وارتشاف العظام في مواقع خارج تجويف الفم ، والذي يلغي تقييم دواعم الأسنان والفم الميكروبيوم27،28،29،30،31.

باستخدام نموذج التي يسببها الاربطه من التهاب اللثة ، وقد تم عاده تثبيت خياطه الحرير مضفر حول المولي الثاني. كبديل ، يمكن ادراج قطعه خطيه واحده من المواد خياطه بين الاولي والثانية أضراس32،33. الهدف من وضع الاربطه هو تسهيل تراكم البكتيريا وتوليد ديسبيوسيس داخل sulci اللثة ، مما ادي إلى التهاب الانسجه اللثة وتدمير الانسجه التي تتكون من دواعم الأسنان. والاهم من ذلك ، هذا النموذج قادر علي إنتاج أكبر بكثير من فقدان العظم السنخيه بالمقارنة مع نموذج أنبوبي الشفوي الأكثر استخداما34. زيادة تعقيد استخدام نموذج أنبوبي عن طريق الفم هو المقاومة الطبيعية من قبل عده سلالات من الفئران (اي ، C57BL/6) لتطوير فقدان العظام السنخيه. هذا هو أيضا إشكاليه, كما ان هذه السلالة هي الأكثر استخداما في البحوث الحيوانية المستندة إلى murine35.

وقد وضعت الإجراءات القائمة التي وصفتها مارتشيسان وآخرون ، وابي وهاجيشينليس لتبسيط القانون التقني الذي يضع الحروف33،36. ولسوء الحظ ، يتطلب البروتوكول السابق معدات متخصصة مطبوعه بالابعاد الثلاثية ولديه القدرة علي فقدان الاربطه المبكرة ، مما يزيد من استخدام الماشية والتكاليف المرتبطة بالوقت الإضافي الذي يقضيه في غرفه العمليات. وعلاوة علي ذلك ، كلا البروتوكولين توليد مناطق صغيره فقط من دواعم الأسنان المريضة المتاحة للدراسة.

وترتكز المزايا التي تكمن في هذه التقنية علي الدراسة المتزامنة لتشوات الفم والمناعة التي تحكم دواعم اللثة ، واستخدام الماشية منخفضه التكلفة ذات الخلفيات الوراثية المتنوعة ، والممارسات البسيطة للإسكان والتربية. وعلي هذا النحو ، ينبغي ان تكون الأهداف هي تعظيم حجم الانسجه المريضة ، وفي محاولة لممارسه مبادئ الحد من البحوث الحيوانية ، خفض الاستهلاك الحيواني إلى مستوي منخفض قدر الإمكان. وهذا يتطلب ضمان ان جميع الكائنات أليفه قادره علي الادراج في التحاليل التجريبية37. ومع ذلك ، تجدر الاشاره إلى انه بغض النظر عن النموذج الحيواني من الامراض اللثة يتم استخدامها ، لا يوجد نموذج واحد الذي يشمل كل عنصر من عناصر الفيزيولوجيا المرضية PD البشرية.

يستخدم هذا البروتوكول الجديد وضع الربط حول أسنان الفك العلوي متعددة باستخدام الاجهزه والمواد الموجودة داخل معظم المختبرات. فانه يسمح كميه كافيه من الوقت لتثبيت بسهوله وبثقة الاربطه التي من غير المرجح ان تقطع قبل الأوان. وأخيرا ، كما يقدم PMNs تنسيق تدمير دواعم الأسنان في PD ، يتم أيضا تقديم منهجيه جديده لاستعاده العدلات عن طريق الفم بطريقه مماثله للبشر.

Protocol

وقد امتثلت جميع الدراسات المتعلقة بالmurine للوائح الاخلاقيه ذات الصلة ووافقت عليها لجنه الرعاية الحيوانية التابعة لجامعه تورنتو ومجلس أخلاقيات البحوث (البروتوكول 20011930). 1. تركيب الاربطه ملاحظه: هذا هو اجراء العمليات الجراحية غير معقمه التي يمكن القيام بها في م?…

Representative Results

ممثل تدفق البيانات الخلوية من عينات شطف عن طريق الفم من ساذج (الشكل 3ا) وملتهبة (الشكل 3ب) murine تجويف الفم الثانوية للتهاب اللثة المستحثة التي يسببها. كما يظهر استرداد PMNs من الاربطه المثبتة (الشكل 3ج). تم معايره الفول?…

Discussion

ويتركز العنصر الأكثر اهميه المرتبطة باستخدام نموذج المستحثة الاربطه من التهاب اللثة حول الاحتفاظ بالاربطه حتى وقت التضحية أو الازاله المتعمدة. الربط بيوفيلم-ريتيكتيف المثبتة قادره علي حمل خسارة كبيره من ارتفاع العظم السنخي في عدد قليل من 6 أيام, الهضاب بين 11 – 16 الفترة اليوم39</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويدعم j. w. c. من قبل المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR). ويود المؤلفون ان يشكروا الدكتور تشونغشيانغ صن علي مساعدتها في أداء التلطيخ الأزرق التريسان.

Materials

Anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend 123131 BV421, Clone BM8
Anti-mouse Ly6G Antibody BD 560602 PerCP-Cy5.5, Clone 1A8
C57BL/6 Male Mice Charles River 8 to 12 weeks old
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB15-500 15 mL
Conical Centrifuge Tube FroggaBio TB50-500 50 mL
FACS Buffer Multiple 1% BSA (BioShop), 2mM EDTA (Merck), 1x HBSS-/- (Gibco)
FACSDiva BD v8.0.1
Fibre-Lite Dolan-Jenner Model 180
FlowJo Tree Star v10.0.8r1
Heat Therapy Pump Hallowell HTP-1500
Hot Glass Bead Sterilizer Electron Microscopy Sciences 66118-10 Germinator 500
Iris Scissors Almedic 7602-A8-684 Straight
Ketamine Vetoquinol 100mg/mL
LSRFortessa BD X-20
Mouse Serum Sigma M5905-5ML
Nylon Mesh Filter Fisher Scientific 22-363-547 40 µm
Paraformaldehyde Fisher Scientific 28908 16% (w/v), Methanol Free
Phosphate-buffered Saline Sigma D1408-500ML Without CaCl2 and MgCl2, 10x
Plastic Disposable Syringes BD 309659 1 mL
Rat Serum Sigma R9759-5ML
Silk Suture Covidien SS652 C13 USP 5-0
Splinter Forceps Almedic 7726-A10-700 #1
Splinter Forceps Almedic 7727-A10-704 #5
Stereo Dissecting Microscope Carl Zeiss 28865 Photo-Zusatz
Sterile Hypodemic Needle BD 305111 26G X 1/2"
Syringe BD 309659 1 mL
Xylazine Rompun 20mg/mL

References

  1. Hajishengallis, G. Immunomicrobial pathogenesis of periodontitis: keystones, pathobionts, and host response. Trends in Immunology. 35 (1), 3-11 (2014).
  2. Pihlstrom, B. L., Michalowicz, B. S., Johnson, N. W. Periodontal diseases. Lancet. 366 (9499), 1809-1820 (2005).
  3. Richards, D. Oral Diseases affect some 3.9 Billion people. Evidence-Based Dentistry. 14 (2), 35 (2013).
  4. Listl, S., Galloway, J., Mossey, P. A., Marcenes, W. Global Economic Impact of Dental Diseases. Journal of Dental Research. 94 (10), 1355-1361 (2015).
  5. Hajishengallis, G. Periodontitis: from microbial immune subversion to systemic inflammation. Nature Reviews Immunology. 15 (1), 30-44 (2015).
  6. Preshaw, P. M., et al. Periodontitis and diabetes: a two-way relationship. Diabetologia. 55 (1), 21-31 (2012).
  7. Kampits, C., et al. Periodontal disease and inflammatory blood cytokines in patients with stable coronary artery disease. Journal of Applied Oral Sciences. 24 (4), 352-358 (2016).
  8. Fitzpatrick, S. G., Katz, J. The association between periodontal disease and cancer: A review of the literature. Journal of Dentistry. 38 (2), 83-95 (2010).
  9. Socransky, S. S., Haffajee, A. D. Periodontal microbial ecology. Periodontology 2000. 38 (1), 135-187 (2005).
  10. Marsh, P. D. Microbial Ecology of Dental Plaque and its Significance in Health and Disease. Advances in Dental Research. 8 (2), 263-271 (1994).
  11. Berezow, A. B., Darveau, R. P. Microbial shift and periodontitis. Periodontology 2000. 55 (1), 36-47 (2011).
  12. Roberts, F. A., Darveau, R. P. Microbial protection and virulence in periodontal tissue as a function of polymicrobial communities: symbiosis and dysbiosis. Periodontology 2000. 69 (1), 18-27 (2015).
  13. Macpherson, A. J., Harris, N. L. Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system. Nature Reviews Immunology. 4 (6), 478-485 (2004).
  14. Hajishengallis, G., et al. Low-Abundance Biofilm Species Orchestrates Inflammatory Periodontal Disease through the Commensal Microbiota and Complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
  15. Löe, H., Anerud, A., Boysen, H., Morrison, E. Natural history of periodontal disease in man. Rapid, moderate and no loss of attachment in Sri Lankan laborers 14 to 46 years of age. Journal of Clinical Periodontology. 13 (5), 431-445 (1986).
  16. Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Experimental Cell Research. 342 (2), 200-209 (2016).
  17. Fine, N., et al. Distinct Oral Neutrophil Subsets Define Health and Periodontal Disease States. Journal of Dental Research. 95 (8), 931-938 (2016).
  18. Landzberg, M., Doering, H., Aboodi, G. M., Tenenbaum, H. C., Glogauer, M. Quantifying oral inflammatory load: oral neutrophil counts in periodontal health and disease. Journal of Periodontal Research. 50 (3), 330-336 (2015).
  19. Bender, J. S., Thang, H., Glogauer, M. Novel rinse assay for the quantification of oral neutrophils and the monitoring of chronic periodontal disease. Journal of Periodontal Research. 41 (3), 214-220 (2006).
  20. Johnstone, A. M., Koh, A., Goldberg, M. B., Glogauer, M. A Hyperactive Neutrophil Phenotype in Patients With Refractory Periodontitis. Journal of Periodontology. 78 (9), 1788-1794 (2007).
  21. Figueredo, C. M. S., Fischer, R. G., Gustafsson, A. Aberrant Neutrophil Reactions in Periodontitis. Journal of Periodontology. 76 (6), 951-955 (2005).
  22. Christan, C., Dietrich, T., Hägewald, S., Kage, A., Bernimoulin, J. -. P. White blood cell count in generalized aggressive periodontitis after non-surgical therapy. Journal of Clinical Periodontology. 29 (3), 201-206 (2002).
  23. Oz, H. S., Puleo, D. A. Animal models for periodontal disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , 1-8 (2011).
  24. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
  25. Baker, P. J., Evans, R. T., Roopenian, D. C. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Archives of Oral Biology. 39 (12), 1035-1040 (1994).
  26. Oz, H. S., Ebersole, J. L. A novel murine model for chronic inflammatory alveolar bone loss. Journal of Periodontal Research. 45 (1), 94-99 (2010).
  27. Zubery, Y., et al. Bone resorption caused by three periodontal pathogens in vivo in mice is mediated in part by prostaglandin. Infections and Immunity. 66 (9), 4158-4162 (1998).
  28. Feuille, F., Ebersole, J. L., Kesavalu, L., Stepfen, M. J., Holt, S. C. Mixed infection with Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum in a murine lesion model: potential synergistic effects on virulence. Infections and Immunity. 64 (6), 2094-2100 (1996).
  29. Yoshimura, M., et al. Proteome analysis of Porphyromonas gingivalis cells placed in a subcutaneous chamber of mice. Oral Microbiology and Immunology. 23 (5), 413-418 (2008).
  30. Kesavalu, L., Ebersole, J. L., Machen, R. L., Holt, S. C. Porphyromonas gingivalis virulence in mice: induction of immunity to bacterial components. Infections and Immunity. 60 (4), 1455-1464 (1992).
  31. Liu, P., Haake, S. K., Gallo, R. L., Huang, C. A novel vaccine targeting Fusobacterium nucleatum against abscesses and halitosis. Vaccine. 27 (10), 1589-1595 (2009).
  32. Jiao, Y., et al. Induction of Bone Loss by Pathobiont-Mediated Nod1 Signaling in the Oral Cavity. Cell Host Microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
  33. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
  34. de Molon, R. S., et al. Long-term evaluation of oral gavage with periodontopathogens or ligature induction of experimental periodontal disease in mice. Clinical Oral Investigations. 20 (6), 1203-1216 (2016).
  35. Baker, P. J., Dixon, M., Roopenian, D. C. Genetic control of susceptibility to Porphyromonas gingivalis-induced alveolar bone loss in mice. Infections and Immunity. 68 (10), 5864-5868 (2000).
  36. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  37. Flecknell, P. Replacement, reduction and refinement. ALTEX: Alternatives to Animal Experiments. 19 (2), 73-78 (2002).
  38. Fine, N., et al. Primed PMNs in healthy mouse and human circulation are first responders during acute inflammation. Blood Advances. 3 (10), 1622-1637 (2019).
  39. Viniegra, A., et al. Resolving Macrophages Counter Osteolysis by Anabolic Actions on Bone Cells. Journal of Dental Research. 97 (10), 1160-1169 (2018).
  40. Häärä, O., et al. Ectodysplasin regulates activator-inhibitor balance in murine tooth development through Fgf20 signaling. Development. 139 (17), 3189-3199 (2012).
  41. Tsukasaki, M., et al. Host defense against oral microbiota by bone-damaging T cells. Nature Communications. 9 (1), 1-11 (2018).
  42. Hiyari, S., et al. Ligature-induced peri-implantitis and periodontitis in mice. Journal of Clinical Periodontology. 45 (1), 89-99 (2018).
  43. Eskan, M. A., et al. The leukocyte integrin antagonist Del-1 inhibits IL-17-mediated inflammatory bone loss. Nature Immunology. 13 (5), 465-473 (2012).
  44. Dutzan, N., et al. A dysbiotic microbiome triggers T H 17 cells to mediate oral mucosal immunopathology in mice and humans. Science Translational Medicine. 10 (463), 1-12 (2018).
  45. Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC Microbiology. 10 (1), 1-8 (2010).
  46. Rovin, S., Costich, E. R., Gordon, H. A. The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germfree and conventional rats. Journal of Periodontal Research. 1 (3), 193-204 (1966).
  47. Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1-7 (2016).
  48. Dutzan, N., et al. On-going Mechanical Damage from Mastication Drives Homeostatic Th17 Cell Responses at the Oral Barrier. Immunity. 46 (1), 133-147 (2017).
  49. Sima, C., et al. Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Down-Regulation in Oral Neutrophils Is Associated with Periodontal Oxidative Damage and Severe Chronic Periodontitis. The American Journal of Pathology. 186 (6), 1417-1426 (2016).

Play Video

Cite This Article
Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils. J. Vis. Exp. (155), e59667, doi:10.3791/59667 (2020).

View Video