De volgende procedure beschrijft een methode voor ruimtelijke en temporele controle van melanocytische tumor initiatie in muizen dorsale huid, met behulp van een genetisch gemanipuleerde muismodel. Dit protocol beschrijft macroscopische en microscopische cutane melanoom initiatie.
Cutane melanoom is bekend als de meest agressieve huidkanker. Hoewel de risicofactoren en belangrijke genetische veranderingen nog steeds worden gedocumenteerd met toenemende diepte, de incidentie van cutane melanoom heeft aangetoond een snelle en continue toename in de afgelopen decennia. Met het oog op effectieve preventieve methoden te vinden, is het belangrijk om de vroege stappen van melanoom initiatie in de huid te begrijpen. Eerdere gegevens heeft aangetoond dat folliculaire melanocyt stamcellen (MCSCs) in de volwassen huid weefsels kunnen fungeren als melanoomcellen van herkomst bij het uitdrukken van oncogene mutaties en genetische veranderingen. Tumorigenesis die voortvloeien uit melanoom-gevoelige MCSCs kan worden geïnduceerd wanneer MCSCs overgang van een rustige naar actieve staat. Deze overgang in melanoom-gevoelige MCSCs kan worden bevorderd door de modulatie van ofwel haarfollikel stamcellen ‘ activiteit staat of door middel van Extrinsieke omgevingsfactoren zoals ultraviolet-B (UV-B). Deze factoren kunnen kunstmatig worden gemanipuleerd in het laboratorium door chemische ontharing, die de overgang van de haarfollikel stamcellen oorzaken en MCSCs van een rustige naar actieve toestand, en door UV-B blootstelling met behulp van een benchtop licht. Deze methoden bieden een succesvolle ruimtelijke en temporele controle van cutane melanoom initiatie in de muizen dorsale huid. Daarom, deze in vivo modelsystemen zal waardevol zijn om de vroege stappen van cutane melanoom initiatie te definiëren en kan worden gebruikt om mogelijke methoden voor de preventie van tumoren te testen.
Melanoom, de kwaadaardige vorm van melanocytische tumoren, is de meest agressieve kanker in de huid met cutane melanoom verantwoordelijk voor de meerderheid van de huidkanker sterfgevallen1. In de Verenigde Staten, melanoom wordt vaak gediagnosticeerd; het is naar verwachting de 5th tot 6e meest voorkomende vorm van kanker onder de geschatte nieuwe kankergevallen in 20182. Bovendien, terwijl de algehele incidentie van kanker hebben aangetoond dat de trend van geleidelijke vermindering van de afgelopen decennia, cutane melanoom incidentie percentages in de afgelopen decennia tonen een continue en snelle toename van beide geslachten2.
Om cutane melanoom efficiënter te bestrijden, is het belangrijk om de vroege gebeurtenissen van melanoom ontwikkeling van hun cellen van herkomst duidelijk te begrijpen om klinisch effectieve preventieve methoden beter te kunnen identificeren. Het is nu bekend dat volwassen stamcellen aanzienlijk kunnen bijdragen aan de vorming van tumoren als de cellulaire oorsprong van kanker in veel verschillende soorten organen, waaronder huid weefsels3,4,5. Evenzo, volwassen melanocyt stamcellen (MCSCs) in de muizen dorsale huid kan werken als melanoomcellen van herkomst bij afwijkende activering van de RAS/RAF en Akt paden6. Echter, deze oncogene mutaties alleen niet in staat zijn om efficiënt te induceren tumorvorming van rustige MCSCs. melanocytische tumoren ontwikkelen zich uiteindelijk wanneer MCSCs actief worden tijdens natuurlijk haar fietsen. Echter, in dit protocol, zullen we beschrijven methoden om kunstmatig induceren cellulaire activering van tumor-gevoelige MCSCs, waardoor de precieze controle van melanoom initiatie6,7.
Door middel van de hier beschreven methoden, ruimtelijke en temporele controle van cutane melanoom initiatie van tumor-gevoelige MCSCs uiten oncogene BrafV600E samen met het verlies van Pten expressie kan met succes worden uitgevoerd, zoals we hebben eerder gemeld6. Deze methode bevat eerdere bevindingen die aantonen haarfollikel stamcel activering door ontharing, alsmede hoe de blootstelling van muizen huid aan UV-B kan vergemakkelijken activering van MCSCs inwoner van de haarfollikel en de verplaatsing van deze cellulaire subpopulatie aan interfollicular epidermis6,8,9,10. Deze in vivo modelsystemen kunnen waardevolle informatie verschaffen over hoe fysiologische en milieuveranderingen de cellulaire status van melanoom-gevoelige MCSCs kunnen veranderen, wat op zijn beurt een significante initiatie van melanoom in de huid kan veroorzaken.
Hallmark genetische veranderingen vaak gevonden in cutane melanoom tumoren zijn goed beschreven13. De meest dominante driver mutatie is BrafV600E, en een genetisch gemanipuleerde muismodel voor BrafV600E-gemedieerde melanoom werd gegenereerd door de Bosenberg groep14 en neergelegd in het Jackson Laboratory. Met behulp van deze muismodel, onze recente studie aangetoond dat de eis van cellulaire activering van tumor-gevoelige MCSCs voor…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Bureau van de adjunct-minister van defensie voor gezondheidszaken, via de peer reviewed kankeronderzoek programma onder gunning W81XWH-16-1-0272. Adviezen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteurs en zijn niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het ministerie van defensie. Dit werk werd ook gesteund door een zaad toelage van het Cornell programma van de stam cel aan A.C. wit. H. de maan werd gesteund door het Cornell centrum voor geleerden van het gewervelde Genomics programma.
Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
26g 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
Cotton swabs | various | ||
Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 x 24 mm |
Isoflurane | various | Veterinary grade | |
Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG | |
Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG | |
Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA | |
Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA | |
Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |