Beurteilung der therapeutischen Angiogenese in einem Murine-Modell von Hindlimb Ischemia
Summary
Hier wird ein kritisches Hinterlimb Ischämie-Experimentalmodell vorgestellt, gefolgt von einer Batterie funktioneller, histologischer und molekularer Tests zur Beurteilung der Wirksamkeit angiogener Therapien.
Abstract
Kritische GliedmaßenIschämie (CLI) ist eine ernste Erkrankung, die ein hohes Risiko für eine Amputation der unteren Gliedmaßen mit sich bringt. Obwohl die Revaskularisation die Goldstandardtherapie ist, ist eine beträchtliche Anzahl von CLI-Patienten weder für chirurgische noch für endovaskuläre Revaskularisation geeignet. Angiogene Therapien entwickeln sich als Option für diese Patienten, werden aber derzeit noch untersucht. Vor der Anwendung beim Menschen müssen diese Therapien in Tiermodellen getestet werden, und ihre Mechanismen müssen klar verstanden werden. Ein Tiermodell der Hinterlimbischämie (HLI) wurde durch die Ligation und Exzision der distalen äußeren Ilias und Femoralarterien und Venen bei Mäusen entwickelt. Ein umfassendes Testgremium wurde zusammengestellt, um die Auswirkungen von Ischämie und vermeintlichen angiogenen Therapien auf funktioneller, histologischer und molekularer Ebene zu bewerten. Laser Doppler wurde für die Durchflussmessung und funktionelle Beurteilung der Perfusion verwendet. Die Gewebereaktion wurde durch die Analyse der Kapillardichte nach der Färbung mit dem Anti-CD31-Antikörper an histologischen Abschnitten des Magen-Darm-Muskels und durch Messung der Konlateralgefäßdichte nach der Diaphonisierung bewertet. Die Expression angiogener Gene wurde durch RT-PCR quantifiziert, das auf ausgewählte angiogene Faktoren ausschließlich in Endothelzellen (ECs) nach Lasererfassungsmikrodissektion von Mäusen gastrocnemius Muskeln abzielte. Diese Methoden waren empfindlich bei der Identifizierung von Unterschieden zwischen ischämischen und nicht-ischämischen Gliedmaßen und zwischen behandelten und nicht behandelten Gliedmaßen. Dieses Protokoll bietet ein reproduzierbares CLI-Modell und ein Framework für die Prüfung angiogener Therapien.
Introduction
Periphere arterielle Erkrankungen (PAD) betreffen vorwiegend die unteren Gliedmaßen. PAD wird durch Arteriosklerose verursacht, eine Arterienverstopfung, die schwere Einschränkung des Blutflusses in den unteren Gliedmaßen verursachen kann1. Intermittierende Claudication ist die erste Manifestation von PAD und bezieht sich auf Muskelschmerzen beim Gehen. CLI ist das schwerste Stadium der PAD, diagnostiziert bei Patienten, die ischämische Ruheschmerzen, Geschwüre oder Gangränzeigen 2. Patienten mit CLI haben ein hohes Amputationsrisiko, insbesondere wenn sie unbehandelt sind3. Die Revaskularisation der unteren Gliedmaßen (entweder durch offene Operation oder ein endovaskuläres Verfahren) ist derzeit der einzige Weg, um Gliedmaßenzubergung zu erreichen. Jedoch, etwa 30% der CLI-Patienten sind nicht für diese Verfahren geeignet, aus Gründen, die die Lage der Läsionen, das Muster der arteriellen Okklusion und umfangreiche Komorbidität4,5. Daher sind neue Therapien für diese ansonsten unheilbaren Patienten erforderlich, wobei die Förderung der Angiogenese die Strategie ist, die intensiver untersucht wird.
Vor tests am Menschen müssen die Wirksamkeit und Sicherheit neuer Therapien in vivo in Tiermodellen berücksichtigt werden. Mehrere Modelle wurden für die Untersuchung von CLI entwickelt, vor allem durch induzierende HinterlimbIschämie (HLI) bei Mäusen6,7,8,9,10. Diese Modelle unterscheiden sich jedoch in mehreren Aspekten, einschließlich der Art der Arterien, die ligiert und/oder ausgeschnitten sind und ob die Venen und Nerven umgeben sowie seziert werden6,7,8, 9,10. Zusammengenommen werden diese Aspekte die Schwere der Ischämie-Reperfusionsverletzung bei jedem Tier beeinflussen, was den Vergleich der Ergebnisse erschwert. Daher ist es wichtig, ein wirksames Protokoll zu entwickeln, in dem das Verfahren zur Induzieren von Ischämie und die Bewertung verschiedener Ziele standardisiert werden sollten, um zu beurteilen, ob eine bestimmte angiogene Therapie wirksam sein wird. Ein experimentelles Protokoll, das alle diese Aspekte abdeckt, würde ein umfassendes Verständnis der Mechanismen bieten, mit denen angiogene Therapien ihre Wirkung entfalten, und ein Maß für ihre Wirksamkeit bei jedem ihrer Ergebnisse. Zwei verschiedene Werke, die kürzlich von unserem Team veröffentlicht wurden, sind ein gutes Beispiel11,12, in dem verschiedene Ansätze zur Induzieren therapeutischen Angiogenese mit dem gleichen Protokoll bewertet wurden, das in diesem Abschnitt ausführlicher beschrieben wird. protokoll.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein reproduzierbares experimentelles Modell zu beschreiben, das die Auswirkungen von CLI imitieren und die experimentelle Grundlage für eine umfassende Bewertung der funktionellen, histologischen und molekularen Wirkungen vermeintlicher angiogener Agents.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murine Modelle der CLI bestanden meist in Ligation der Femoralarterie nur distal zum Ursprung der profunda femoris 4,5,6,7,8,9. Dies hat gezeigt, dass der größte Teil der Kollateralzirkulation intakt bleibt, was den Blutfluss in die Gliedmaßen innerhalb von 7 Tagen wiederherstellt 9. Die Entfernung …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken José Rino und Ténia Carvalho, Leiter der Bioimaging Facility und Histologie und Vergleichendes Pathologielabor des Instituto de Medicina Molecular Joo Lobo Antunes. Wir danken auch Vyacheslav Sushchyk von der Abteilung für Anatomie der Nova Medical School/Faculdade de Ciéncias Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Förderreferenz: Projekt, das von UID/IC/0306/2016 Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia finanziert wird. Paula de Oliveira wird durch ein Stipendium (SFRH/BD/80483/2011) von Fundaéo para a Ciéncia e Tecnologia unterstützt.
Materials
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution – nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution – toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution – toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
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