מאמר זה מתאר זרימה מבוססת-סריג cy, מבוסס הפרוטוקול כדי לכמת הרכבה עצמית חלבון בשני S. cerevisiae ס ו HEK293T תאים.
הרכבה עצמית חלבון שולטת בתפקוד החלבונים וממדר תהליכים סלולאריים בחלל ובזמן. שיטות נוכחיות ללימוד המידע סובלות מרגישות נמוכה, הפרדה עקיפה, תפוקה מוגבלת ו/או רמת אוכלוסיה במקום רזולוציה של תא בודד. עיצבנו את הזרימה cy, מבוססי מתודולוגיה אחת המטפלת בכל המגבלות האלה: להפיץ את החלק האחר של המגבלות. DAmFRET מזהה וכימות חלבון הרכבות עצמית על ידי הפליטה רגישות לvivo, מאפשר פריסה על פני מערכות דגם-מ שמרים לתאים אנושיים-ומשיגה רגיש, תא יחיד, התפוקה הגבוהה לקרוא-outs ללא קשר לחלבון לוקליזציה או מסיסות.
Assays ללמוד אינטראקציות חלבון הומוטיפקס, או “הרכבה עצמית” הם חשובים משום המדינה oligomeric מסיסות של חלבונים להכתיב את תפקידם. הפרוטדום שופעת עם הומו-מוטיימרים1,2,3,4, ואילו חלבונים מעטים יחסית לתפקד monomers. חלבונים יכולים גם להרכיב סטיות בשל מתח, גיל, או misregulation, המוביל שינויים פתולוגיים בפעילות. זיהוי הגורמים לווסת אירועים כאלה, או אפילו את טבעו הפיזי של ההרכבות, הוא לעתים קרובות מאתגר במיוחד.
מספר גדל והולך של חלבונים מזוהים כעת כדי להרכיב את עצמו עם הקופרקטיביות יוצאת דופן ו stoichiometry לא מזוהה, וכתוצאה מכך הם מחדירים שלהם ממרכיבים סלולריים אחרים, כמו חלבון-שלבים צפופים. אלה לוקחים את הצורה של מעבים מסודר, כגון טיפות ג ‘ לים, או חוטים מסודרים מאוד, כגון סיבי עמילואיד. התנודות הכרוכות בקשר עם האחרון מייכבות את הקמתה הראשונית, או התגררות, באופן מיסודו במישור המולקולרי,5,6. בגלל ההסתברות של התגררות קשקשים עם נפח, היווצרות של מכלולים כאלה יכול להיות סטוכסטי מאוד בתחומי המרחבי של תאים חיים7,8. בקיצוניות של הפרדה סטוכסטית-שלב מוגבל הם prions, מכלולי חלבון מסודרים מאוד, שרק לעתים רחוקות נוקלאוונים באופן ספונטני, אך לאחר שנוצרו, תבנית הצמיחה שלהם ללא הגבלת זמן. אחד כזה חלבון, המכונה עולה, מבצע מתג מסוג prion הדיגיטלי בפעילות של תאים חיסוניים מולדים היונקים. הרכבה עצמית עולה הוא התגרדת על ידי האינטראקציה שלה עם חלבונים ספציפיים כי יש לעצמם oligomerized על הפתוגן מחייב-או הקשורות לסכנות דפוסי מולקולרי. ההרכבות עולה בתורו את הנוקלאואטה procaspase-1 כדי להרכיב את עצמו ולהפעיל, המוביל התבגרות cy, ו פירוציטוזה של התא9,10. האזור של עולה אחראי על ההרכבה שלו שייך לתחום המוות של משפחה, אשר מורכב מעל 100 חברים בפרוטאום אנושי. למרות התפקידים הבולטים של תחומי המוות בחסינות הטבועה ומוות התאים המתוכנת, רובם עדיין לא האופיינים ביחס להתכנסות עצמית. גילוי ואפיון של חלבונים נוספים עם התנהגות כזו יהיה מאוד הקלה על ידי ישיר, תא יחיד הבדיקה של הרכבה עצמית חלבון.
ביוכימיה קלאסית בביוכימיה גישות לחקר הרכבה עצמית חלבון, כגון כרומטוגרפיה להדרה בגודל והסתבכות, מוגבלים במידה רבה להערכות ברמת האוכלוסייה. עם זאת, הטרוגניות תא לתאים הנובע ממעברים מוגבלים בפאזה מוגבלת, לא ניתן למודל ברמת פירוט זו. גישות תא יחיד המבוססות על מיקרוסקופ הקרינה מחדש את היכולת הזאת, אבל חסר את התפוקה הנחוצה כדי לכמת במדויק בודד או לזהות מכלולים נדירים. יתרה מזאת, מכלולים עצמיים מסיסים כמו רוב האנזימים והטרום-עמילואיד, הם קטנים מדי וניידים כדי להיפתר על-ידי מיקרוסקופ אור רגיל. הם יכולים להיות מזוהה על ידי גישות מתוחכמות יותר כגון ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית, אבל אלה מוגבלים מאוד מספר התא ותפוקה.
מבוסס קרבה מבוססת על הרכבה חלבון, כגון לפצל ומפוצל fluorophore משלימה, מציעים פתרון פוטנציאלי לבעיות אלה. עם זאת, הם בדרך כלל דורשים שימוש בשני מבנים שונים המבטאים את החלבון של עניין התמזגו תגים משלימים-התורם וקבלה fluorophores במקרה של לדאוג. פעולה זו פוגעת בתפוקה הניסיונית וגם מפחיתה את הרגישות עקב וריאציה של תא לתאים ברמות היחסיות של התורם והקבלה. כדי לעקוף את זה, עיצבנו שיטת הפעלה של פוטולופור, mEos 3.111, אשר מאפשר לבנות בודד לבטא גם תורם וגם לקבלה-מתויג חלבון. ספקטרום הפליטה של mEos בלתי מומרים 3.1 (תורם כמו GFP) חופף מספיק עם הספקטרום עירור של המרת mEos 3.1 (dsRed-כמו הקבלה) כדי לאפשר לדאוג להתרחש כאשר המולקולות נמצאים בסמיכות (< 10 ננומטר). כך, על ידי חשיפת התאים למינון מדומה של האור 405 ננומטר, אשר ממיר את החלק האופטימלי של mEos 3.1 הכולל לתוך טופס הקבלה, אנו משיגים רמות יחסיות של התורם והקבלה על פני דגימות מרובות, רמות ביטויים וניסויים. אנו מודדים את האפשרות הפלואורסצנטית בעת התרגשות גם ישירות עם 561 ננומטר אור, או בעקיפין (על ידי העברת אנרגיה מן התורם) עם 488 האור ננומטר (כלומר, פליטה רגישות מועבר). אנו מדווחים על הרכבת החלבונים כיחס של שני ערכים אלה ומונח זה האמפילוגית או AmFRET.
על מנת לחשב ריכוז חלבונים על ידי הזרמת cy, אנו מחשבים תחילה את עוצמת הזריחה הממוצע של Spc42 מתויג עם mEos 3.1. מכיוון שתאי שמרים מכילים כ 1000 מולקולות של Spc42, לאחר מכן אנו מחשבים את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית של המולקולה הירוקה בודדת של mEos 3.1. על-ידי מינוף צילום ההמרה אפילו בכל הריכוזים הסלולריים (איור 1E), לאחר מכן להתאים את הסכום הכולל של meos 3.1 ערכי הזריחה עבור כל הכוונות לקבלה בעקבות photoconversion. אנחנו אז מסוגלים לחלק את המספר הכולל של שומות של חלבונים פלורסנט על ידי נפח cytosolic משוער (כפי שנקבע באמצעות זרימת הדמיה cy, מנסה) כדי להשיג את הריכוז הכולל ציטוסולמיות של חלבון הריבית. לחישובים מדויקים, אנא ראו את כתב היד המקורי8.
על ידי ביטוי חלבון mEos 3.1-מותך מתוך שמרים, אנו לחקור מגוון של כ-1000 קיפול של ריכוז חלבונים בכל מדגם8. אנו להשיג אותו בתאי HEK293T על ידי המוסריות של הווריאציה ספיגה פלמיד במהלך הזיהום, ומכאן מספר עותק משתנה.
ההתפלגות המתקבלת של AmFRET או DAmFRET עבור אלפי תאים רבים חושף את התלות הריכוז של הרכבה עצמית ב ציטוסול עבור כל חלבון של עניין. באופן כללי, DAmFRET מייצגת מתודולוגיה מאפשרת לגלות ולאפיין את ההרכבה העצמית של החלבון עם שילוב חסר תקדים של רגישות, תפוקה והפיכת שינויים.
בעוד שימוש בסייטומטר הדמיה מאפשר לנו להשיג במידות ריכוז vivo חלבונים, ציטוטומטרים כאלה אינם זמינים עדיין ברוב מוסדות המחקר. עם זאת, DAmFRET ניתן להפעיל גם cytometer אופייני לא הדמיה כדי לקבל הפצות של הרכבת חלבון על מגוון של ביטוי חלבון.
DAmFRET היא השיטה המקיפה ביותר לזיהוי הרכבה עצמית של חלבון בvivo. DAmFRET משלבת לקריאה ישירה של אינטראקציות חלבונים בחלבון הומוטיפקס על מגוון רחב של ריכוז, עם רזולוציית תא בודדת ותפוקה גבוהה. הקריאה הישירה של DAmFRET והעובדה כי חלבונים התמזגו אינם דורשים לוקליזציה מסוימים subcellular או מדינה מפוסל מבטלת תוצאות חיוביות שווא ומרחיב את הישימות שלה למגוון רחב של חלבונים במיקומים שלהם subcellular. בעיקר, על-ידי תיוג אורגלים עם fluorophores התואמים ביותר עם mEos 3.1, כגון T-ספיר ו Mקרדינאל, לוקליזציה subcellular של צורות מסיסים ומורכבים של חלבונים ניתן לקבוע לצד DAmFRET.
באמצעות ההדמיה זרימת cytometer כפי שמתואר כאן, זה לוקח 8 h כדי לנתח צלחת 96-באר עם כ 20,000 תאים מגודרת בכל טוב. עם זאת, אנו גם לבצע באופן שגרתי DAmFRET עם תקן (ללא הדמיה) cytomטומטריים המשיגים תפוקה גבוהה יותר (עד 20 דגימות לדקה). למעשה, כל הזרם cytometer עם מופרדים מ488 ו 561 לייזרים nm כי הוא בחינם מחפצים יומן הרישום יש PMTs המתאים ומסננים לזיהוי תורם, לדאוג, ואותות לקבלה הוא מספיק כדי לבצע DAmFRET. כיום, רווח זה בתפוקה מגיע על חשבון מידע לוקליזציה וקביעת עוצמה, כך שהרכבה עצמית צריכה להיות מנותח כפונקציה של ביטוי חלבונים ולא ריכוז. זו אינה בעיה לניתוח איכותני. בנוסף, ייתכן שניתן יהיה להעריך את הנפח ציטוסולג על ידי החדרת fluorophore ברורים באופן שונה כדי אנדוגני “משק” החלבון אשר הביטוי באופן הדוק עם נפח cytosolic.
כפי שאנו הפגינו דרך הפריסה שלנו של DAmFRET בתאי שמרים וממגלית, ניתן להתאים בקלות למערכות ביטויים שונות. זה מאפשר הרכבה עצמית של חלבונים ללמוד בהקשרים הסלולר הילידים שלהם. כמו-כן, היא מציעה את היכולת להשוות את מכלול החלבון לאורך מודלים מפוצלים של תרבות התא כדי ללמוד את שימור המנגנונים השולטים בהרכבה עצמית של חלבון.
The authors have nothing to disclose.
אנו רוצים להודות לג לנג, ג’יי נגשתי, ג’יאנג’נג וו, טאריקה חאן ואלן קטר על עבודתם לקראת פיתוח הבקשה. עבודה זו נעשתה על מנת למלא, בין השאר, את הדרישות של מחקר התזה לדוקטורט עבור T.S.K. ו-A. R כסטודנטים הרשומים באוניברסיטה הפתוחה, בריטניה ומכון הסטורים ללימודי רפואה בבית הספר, ארה ב, בהתאמה. מידע נוסף הקשור לאלה ניתן למצוא ב https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. ניתן לגשת לנתונים המקוריים שבבסיס כתב יד זה ממאגר הנתונים המקורי של סטורס ב-http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. העבודה הזאת ממומנת על ידי פרס העצמאות המוקדמת של מנהל NIH DP5-OD009152, מארס של מטבעות המלך 5-FY17-32, ומכון הסטודרים למחקר רפואי.
תרומות לכותב הן כדלקמן. המשמה: T.S.K., S.V. וR.H.; מתודולוגיה: T.S.K., S.V., A.R.G. ו-A. B; תחקיר: S.V., T.S.K. וA.R.G.; אנליזה פורמלית: S.V. ו-T.S.K.; היווצרות נתונים: T.S.K.; הדמיה: T. S. K, ו S.V., כתיבה (טיוטה מקורית): S.V., ו T.S.K.; כתיבה (סקירה, עריכה): R.H., S.V. ו-T.S.K.; ורכישת מימון: R.H.
96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
DMEM | Gibco | 11966025 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
Mammalian Cells | HEK293T | ||
mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
PenStrep | Gibco | 15070063 | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |