종양 미세 환경은 암 성장과 침략의 필수적인 부분입니다. 암의 진행을 모방 하기 위해 생물학적으로 관련 된 인간 매트릭스가 필요 합니다. 이 프로토콜은 인간 평활 근 종 기반 매트릭스를 적용 하 여 시험관 내 3 차원 세 포스 페 로이드 침입 검정에 대 한 개선을 도입 한다. 이 프로토콜은 또한 컴퓨터 기반 세포 침입 분석을 소개 합니다.
2 차원 세포 배양 기반 분석 법은 시험관 내 암 연구에서 흔히 사용 된다. 그러나, 그들은 종양 미세 환경을 형성 하는 몇 가지 기본 요소 부족. 보다 신뢰할 수 있는 시험관 내 결과를 얻기 위해, 몇몇 3 차원 (3d) 세포 배양 분석 법이 도입 되었다. 이러한 검정은 암 세포가 세포 외 기질과 상호작용할 수 있게 합니다. 이 상호 작용은 세포 형태학 뿐 아니라 증식 및 침략과 같은 세포 행동에 영향을 미칩니다. 추가적으로,이 상호 작용은 몇몇 프로 및 항 종양 분자의 발현을 유도 하거나 억제할 수 있었습니다. 스 페 로이드 침략 분석은 암 세포 침입을 연구 하기에 적합 한 3D 시험관 내 방법을 제공 하기 위해 개발 되었다. 현재 마우스 육 종 유래 매트릭스 (MSDM)와 쥐 꼬리 유형 I 콜라겐과 같은 동물 유래 매트릭스는 주로 스 페 로이드 침입 분석에 사용 됩니다. 인간 종양 미세 환경과 동물 유래 매트릭스의 차이를 고려 하 여, 인간 근 종 유래 매트릭스 (HMDM)는 양성 자 궁 평활 근 종 조직 으로부터 개발 되었다. HMDM은 MSDM 보다 더 나은 암 세포의 이주와 침략을 유도 하는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜은 HMDM/피 브린 매트릭스를 사용 하는 단순 하 고 재현성이 높고 신뢰할 수 있는 3D 인간 종양 기반 세 포스 페 로이드 침입 분석 법을 제공 했습니다. 또한 이미징 및 분석에 대 한 자세한 지침이 포함 되어 있습니다. 구형 oid는 HMDM/피 브린 매트릭스 내 U 자형 초 저 부착 플레이트에서 성장 하 고이를 통해 침입 합니다. 침공 매일 이미지, 측정, 그리고 일 아 티 스크와 피지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 분석. 분석 플랫폼은 인간 후 두 일차 및 전이성 편평 세포 암 세포 주를 사용 하 여 입증 되었다. 그러나, 상기 프로토콜은 다른 고 형 암 세포 주에도 적합 하다.
종래의 2 차원 (2D) 세포 배양 연구는 암 연구에 상당히 기여 하였다. 현재, 연구원은 더 나은 생체 내 조건1을 모방 하기 위하여 3 차원 (3d) 세포 배양 분석을 향해 더 이동 하 고 있습니다. 상기 3 차원 암 세포 배양 액은 세포 세포 및 세포 기질 상호작용, 유전자 발현 프로필, 약물 감수 성 및 신호 전달 경로의 활성 측면에서 복잡 한 종양 미세 환경을 보다 정확하 게 반영 한다.
여러 가지 3 차원 세포 배양 모델은 종양 조직에 대 한 종양의 설명과 같은 암 연구에 사용 되는, 칩 상에 서, 그리고 다중 세포 종양 스 페 드 로이드3,4. 다중 세포 종양 구형은 현재 인간 종양1,5에서 생체 내 조건의 여러 특징을 모방 함에 따라 널리 사용 되 고 있다. 스 페 로이드 직경이 500 μ m 보다 크면, 저 산소 부위 및 괴 사 중심을 갖고,이에 따라 생체 내 종양 상황2를 나타내는 것 이다.
많은 합성 (예를 들면, 실록) 및 동물 유래 (예를 들어, 랫 트 테일 타입 I 콜라겐 및 마우스 육 종 유래 매트릭스, msdm 이라고 함) 매트릭스는3차원 세포 배양 분석 실험을 위해 개발 되어 왔으며, 7,8. 지금까지, 상업적으로 이용 가능한 기질 중 누구도 인간 종양 조직에서 유래 하지 않았습니다. 따라서 암 세포 침 습 과정8에 상당한 영향을 미치는 인간 종양 미세 환경의 특징이 결여 되어 있다.
묘 겔 (HMDM으로 지칭 되는 인간 근 종 유래 매트릭스)은 인간 자 궁 근 종 종양 조직9로부터 추출 된다. HMDM의 단백질 함량이 MSDM의 단백질과 크게 다르다는 것이 밝혀졌습니다. 사실, HMDM 단백질의 66%는 MSDM 단백질과 다릅니다. 한편, 라미 닌, IV 형 콜라겐, 헤 파란 설 페이트 proteoglycans, 니도 겐 및 표 피 성장 인자와 같은 일부 단백질은 모두 매트릭스10에 존재 한다. 추가적으로, 마우스는 효소 내용에서 인간과 다르지만, 인간으로는 생쥐11보다 78 더 적은 단백질 분해를 갖는다.
피 브린은 단독으로 또는 다른 물질과 결합 하 여 스 캐 폴드 재 (12)로 널리 사용 되 고 있다. 3 차원 세포 배양 분석에서, 상업적으로 입수 가능한 인간 피 브리 노 겐 및 트 롬 빈이 결합 하 여 피 브린 하이드로 겔 (12)을 형성 한다.
이 프로토콜은 이전에 도입 된 3 차원 종양 세 포스 페 로이드 침입 분석 법7의 개선을 설명 한다. 이 새로운 프로토콜은 마우스 유래 종양 매트릭스 대신에 인간 종양 유래 매트릭스를 적용 합니다. 그것은 또한 일 아 티 스크와 피지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 이미징 및 분석 기술을 포함 한다. 이 프로토콜은 여러 가지 고체 암 세포 주의 세 포스 페 로이드 분석에 사용 될 수 있습니다. 그것은 새로운 항 암 치료를 개발 하 고 암 세포 침략에 특정 분자의 효과 연구 하는 생물학적으로 관련 된 도구를 제공 합니다.
제시 된 방법은 인간 종양 미세 환경 모방 행렬 내에서 암 세포의 침투성을 평가 하는 3 차원 인간 종양 기반 분석을 제공 한다. 암 세포 침략은 표준 현미경으로 매일 화상 진 찰과 심상 분석 소프트웨어를 사용 하 여 쉽게 측정 될 수 있습니다. 이 방법은 단순히 증식 하는 것이 아니라 세포 침공을 보여줍니다.
MSDM과 달리 HMDM/피 브린 매트릭스는 온도 제어가 필요 하지 않습니다. 이 방법은, 특히 한 플레이트에서 다른 판으로 구형 oid를 전송할 필요 없이, 수행 하기 쉽다. 그것은 단지 하나의 기술적으로 민감한 단계, 매트릭스에 피 브리 노 겐의 추가. 피 브리 노 겐은 몇 분 후 겔을 시작 하기 때문에, 피 브리 노 겐을 추가 하려면 한 번에 몇 개의 웰만을 강력 하 게 파이 펫 팅 하 고 처리 해야 합니다. 또한 파이 펫 팅이 고압 방식으로 수행 되는 경우 스 페 로이드를 교란 하 고 U 자형의 중심 위치에서 이동 하는 위험이 있습니다. 구형 체의 전위는 이미징 및 결국 분석을 복잡 하 게 할 수 있습니다.
분석은 HMDM 또는 피 브리 노 겐의 농도를 변경 하 여 수정할 수 있습니다. 세포는 또한 뒤에 오는 분자 연구를 위해 고정 되 고 염색 될 수 있습니다. 이 방법은 완전히 자동화 된 형태로 수정 될 수 있지만, 일반 현미경과 두 개의 오픈 소스 소프트웨어로 수행 할 수 있으며 값비싼 장비가 필요 하지 않습니다.
기존의 MSDM 기반 3D 분석과 비교 하 여,이 분석은 세포 침 습 특성을 더 잘 나타낼 수 있었다. MSDM과 같은 지 하 막 함유 라미 네이션이 풍부한 매트릭스에서 성장 하는 구형 체는 실제 침 윤 보다 암 세포의 증식이 더 많을 수 있으며,이는 낮은 침입 용량으로 인해 여러 암 세포 주에서 침략 분석에 부적합 합니다. 또 다른 자주 사용 되는 매트릭스 인 I 형 콜라겐은 3 차원 배양 시 가장자리에서 줄어드는 경향이 있으며,이는 스 페 로이드 현지화와 웰의 이미징에 영향을 줍니다. 또한 인간 종양 미세 환경 모방 모델 (myoma 디스크 및 그것의 녹는 형태)를 사용 하 여 더 많은 (HSC-3) 및 더 적은 (SCC-25) 공격적인 혀 암 세포 주에 대 한 내재 성 침 습 적 성질 간의 차이가 입증 되었습니다 10,13.
이 분석은 또한 인간 근 종 종양의 잔여 물질 로부터 HMDM이 추출 되기 때문에 MSDM을 사용 하는 것 보다 더 윤리적 이다. 현재, hmdm은 인간 종양 유래 ECM 제품으로 서, 많은 암 관련 시험관 내 분석8,10에 적합 한 것으로 보인다. 앞으로 동물 조직 유래 매트릭스는 매트릭스 생산을 위해 동물을 희생할 필요성을 줄이기 위해 인간 종양 기반 매트릭스로 대체 될 수 있습니다.
2D 세포 배양 분석을 3D 방법으로 대체 하면 암 세포 거동에 대 한 보다 정확한 정보를 제공 합니다. 현재 여러 가지 3D 모델과 상업용 행렬이 있지만 불행히도 모든 암 세포 주에 적합 한 것은 없습니다. 연구원은 그들의 특정 분석을 위한 가장 적합 한 매트릭스를 선택 해야 합니다. 분석 및 매트릭스의 최적 매칭은 까다로울 수 있지만 결과의 신뢰도를 현저 하 게 높일 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는이 연구의 기금 자에 게 감사 합니다: Sigrid 주 리소 재단, 핀란드 암 학회, 헬싱키 대학 중앙 병원 연구 기금. 저자는 기술 도움을 위해 헬싱키 대학의 바이오 메디 움 이미징 유닛을 인정 합니다.
Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56°C in waterbath before use. |
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H₂O. Warm the H₂O and the fibrinogen to 37°C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70°C should be thawed in a water bath maintained at 37°C. |
Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
Myogel | Lab made | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
Trypsin-EDTA (0.5%) 10X, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |