Summary

Измерение потенциальных показателей сокращения диссимиляций нитратов до аммония на основе 14NH4и/15NH4- Анализы с помощью последовательного преобразования в N2O

Published: October 07, 2020
doi:

Summary

Подробно представлен ряд методов определения потенциальной скорости DNRA+ на основе анализа 14NH4+и15NH4. NH4 преобразуется+ в N2O через несколько этапов и анализируется с помощью четырехугольной газовой хроматографии-масс-спектрометрии.

Abstract

Важность понимания судьбы нитратов (NO3),которыеявляются доминирующими видами N, перешел из наземных в водные экосистемы, возрастает, поскольку глобальные нагрузки азота резко возросли после индустриализации. Диссимиляция снижения нитратов до аммония (DNRA) и денитрификации являются микробными процессами, которые используют NO3для дыхания. По сравнению с денитрификацией количественные определения деятельности ДНР были проведены лишь в ограниченных масштабах. Это привело к недостаточному пониманию важности DNRA в No3 преобразования и регулирующие факторы этого процесса. Цель настоящего документа заключается в предоставлении подробной процедуры измерения потенциальной скорости DNRA в экологических пробах. Короче говоря, потенциальная ставка DNRA может быть рассчитана из 15N-маркированы аммония (15NH4)скорость накопления в 15No3 добавил инкубации. Определение концентраций 14NH4 и+ 15NH4, описанных в настоящем документе, состоит из следующих шагов. Во-первых, NH4в образце извлекается и в ловушке на подкисленные стеклянный фильтр, как соль аммония. Во-вторых, захваченный аммоний элализован и окисляется до NO3 через окисление персульфата. В-третьих, NO3преобразуется в N2O с помощью N2O редуктазы недостаточного денитрификации. Наконец, преобразованный N2O анализируется с помощью ранее разработанной четырехугольной газовой хроматографии-масс-спектрометрии. Мы применили этот метод к соляным болотным отложениям и вычислили их потенциальные показатели DNRA, продемонстрировав, что предлагаемые процедуры позволяют просто и быстрее определить по сравнению с ранее описанными методами.

Introduction

Искусственный синтез азотных удобрений и их широкое применение сильно повлияли на глобальный азотный цикл. Подсчитано, что передача реактивного азота из наземных в прибрежные системы удвоилась с доиндустриальных времен1. Значительная часть удобрений, применяемых к данному полю, смывается из почвы в реки или грунтовые воды, в первую очередь в качестве No3и 2. Это может вызвать экологические проблемы, такие как загрязнение питьевой воды, эвтрофикация, и образование гипоксии. NO3– в водной среде удаляется из экосистемы или сохраняется в ней с помощью биологической ассимиляции и различных микробных диссимилятных процессов. Денитрификация и анаммокс, как известно, основные микробные процессы удаления no3. Денитрификация – это микробное сокращение NO3 до газоистых продуктов N (NO, N2O и N2)в сочетании с окислением донора электронов, таких как органические вещества, тем самым снижая риск вышеупомянутых проблем. Anammox также производит N2 из NO2и NH4+; таким образом, он удаляет неорганические N из экосистемы. И наоборот, DNRA работает над сохранением N в экосистеме; общепризнано, что DNRA выполняется в первую очередь ферментативными бактериями или хемолитоавтотрофными бактериями и что они уменьшают диссимилятивные NO3 до биодоступных и менее мобильных NH4.

Исследования по DNRA в основном проводились в морских или лиманных экосистемах, таких как океанические или лиманные отложения и вода, соляная или солоноватая болотистая почва и мангровые почвы. Прибрежные или морские экосистемы имеют важное значение вкачестве водохранилищ для удаления NO 3 – из наземных экосистем, и в предыдущих исследованиях DNRA было показано, что вклад в течение очень широкого диапазона No3 – удаление (0-99%)3,4,5,6,,7,,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 , 18.18 Кроме того, существование DNRA было продемонстрировано в широком диапазоне сред, включаяпресноводные среды 19,рисовыерисовые почвы 20,и лесныепочвы 21. Хотя эти исследования показали, что DNRA потенциально сопоставима с денитрификацией для удаления No3, исследования, измеряя активность DNRA, по-прежнему очень ограничены по сравнению с теми, которые измеряют денитрификацию.

Скорость DNRA была оценена с использованием 15 методовN-маркировки в сочетании с анализом данных с помощью аналитических или численных моделей. Одно аналитическое решение для расчета ставки DNRA основано на увеличении 15N обогащения NH4 и+ пула после добавления 15NO3в качестве трассировщика. 15 Лет N-маркировка No3 добавляется в образец и инкубируется, и скорость DNRA может быть рассчитана на основе изменений соотношенияконцентрации и изотопов+ в NH 4 до и после определенного периода времени. В настоящем документе подробно описан методколичественной оценки концентрации+ NH 4 и коэффициента изотопов, которые необходимы для расчета скорости DNRA. В основном, метод сообщил здесь представляет собой сочетание нескольких ранеесообщалось методы 22,23,24,25,26 с изменениями, добавленных к некоторым процедурам. Метод состоит из серии из пяти компонентных процедур: (1) инкубация образца окружающей среды с поправкой на стабильный изотопный трассировщик, 15NO3,(2) извлечение и восстановление NH4 –сиспользованием “процедуры диффузии” с модификациями, (3) окислениецинульфата+ NH 4 в образце, состоящий из коренных NH + 4+ и 15NH4, полученных из 15NO3– через деятельность DNRA, в No3 и 15NO3, (4) последующей микробной трансформации No3 и 1 No3 до N2O изотопомеры с помощью модифицированного метода денитрификатора и (5) количественной оценкиизотопомеровN 2 O с использованием газовой хроматографии-масс-спектрометрии (GC/MS). В следующем разделе, во-первых, описана подготовка к процедурам (2) и (4), а затем, впоследствии, подробно описаны все пять компонентных процедур.

Protocol

1. Подготовка конверта PTFE для количественного захвата газичный NH3 Поместите 60-мм кусок полиэтилена (PTFE) ленты (25 мм в ширину) на небольшой лист алюминиевой фольги (примерно 300 мм х 450 мм в размерах, протертый этанолом). Пепел фильтр стеклянного волокна (10 мм в диаметре с поры …

Representative Results

Репрезентативные результаты, представленные в настоящем документе, были получены в результате 15экспериментов по отслеживанию отложений соленого болота. Пробое соляного болота было недавно создано после Великого восточно-японского землетрясения 2011 года в рай?…

Discussion

Соотношение концентрации и изотопов NH4 дляанализа DNRA было количественно оценено с помощью нескольких методов. Коэффициенты концентраций и изотопов NH4,как правило, измеряются отдельно. Концентрация NH4 ,как правило, измеряется с помощью колоритных мет?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Наото Танака за помощь в сборе данных и разработке протокола. Сбор образцов был поддержан JSPS KAKENHI Грант номер 17K15286.

Materials

15N-KNO3 SHOKO SCIENCE N15-0197
15N-NH4Cl SHOKO SCIENCE N15-0034
20 mL PP bottle SANPLATEC 61-3210-18 Wide-mouth
Aluminum cap Maruemu 1307-13 No. 20, with hole
Boric acid Wako 021-02195
Centrifuge HITACHI Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector SANSIN INDUSTRIAL IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter ADVANTEC 25CS020AS Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe Termo SS-10SZ 10 mL
Disposable syringe Termo SS-01T 1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) NISSUI PHARMACEUTICAL 5913
Gastight syringe VICI Valco Instruments 4075-15010 Series A-2, 100 µL
GC/MS shimadzu GCMS-QP2010ultra
GF/D Whatman 1823-010 10 mm in diameter
Glass vial Maruemu 0501-06 20 mL
Gray butyl rubber stopper Maruemu 1306-03 No.20-S
H2SO4 Wako 192-04696 Guaranteed Reagent
K2S2O8 Wako 169-11891 Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl Wako 163-03545 Guaranteed Reagent
KNO3 Wako 160-04035 Guaranteed Reagent
NaOH Wako 191-08625 Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl Wako 017-02995 Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube ASONE 1-3500-22 50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens American Type Culture Collection (ATCC) ATCC 13985 Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape Sigma-Aldrich Z221880 25 mm in width
Reciprocating shaker TAITEC 0000207-000 NR-10
Screw-cap test tube IWAKI 84-0252 11 mL
PTFE-lined cap for test tube IWAKI 84-0262
Tryptic Soy Broth Difco Laboratories 211825

References

  1. Gruber, N., Galloway, J. N. An Earth-system perspective of the global nitrogen cycle. Nature. 451 (7176), 293-296 (2008).
  2. Galloway, J. N., et al. The Nitrogen Cascade. Bioscience. 53 (4), 341-356 (2003).
  3. Rysgaard, S., Risgaard-Petersen, N., Sloth, N. P., Caumette, P., Castel, J., Herbert, R. Nitrification, denitrification, and nitrate ammonification in sediments of two coastal lagoons in Southern France. Coastal Lagoon Eutrophication and Anaerobic Processes (C.L.E.AN.). Developments in Hydrobiology. 117, 133-141 (1996).
  4. Christensen, P. B., Rysgaard, S., Sloth, N. P., Dalsgaard, T., Schwærter, S. Sediment mineralization, nutrient fluxes, denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in an estuarine fjord with sea cage trout farms. Aquatic Microbial Ecology. 21, 73-84 (2000).
  5. Tobias, C. R., Anderson, I. C., Canuel, E. A., Macko, S. A. Nitrogen cycling through a fringing marsh-aquifer ecotone. Marine Ecology Progress Series. 210, 25-39 (2001).
  6. An, S. M., Gardner, W. S. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) as a nitrogen link, versus denitrification as a sink in a shallow estuary (Laguna Madre/Baffin Bay, Texas). Marine Ecology Progress Series. 237, 41-50 (2002).
  7. Gardner, W. S., et al. Nitrogen fixation and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) support nitrogen dynamics in Texas estuaries. Limnology & Oceanography. 51 (1), 558-568 (2006).
  8. Preisler, A., et al. Biological and chemical sulfide oxidation in a Beggiatoa inhabited marine sediment. The ISME Journal. 1 (4), 341-353 (2007).
  9. Gardner, W. S., McCarthy, M. J. Nitrogen dynamics at the sediment-water interface in shallow, sub-tropical Florida Bay: why denitrification efficiency may decrease with increased eutrophication. Biogeochemistry. 95 (2-3), 185-198 (2009).
  10. Dong, L. F., et al. Changes in benthic denitrification, nitrate ammonification, and anammox process rates and nitrate and nitrite reductase gene abundances along an estuarine nutrient gradient (the Colne estuary, United Kingdom). Applied and Environmental Microbiology. 75 (10), 3171-3179 (2009).
  11. Koop-Jakobsen, K., Giblin, A. E. The effect of increased nitrate loading on nitrate reduction via denitrification and DNRA in salt marsh sediments. Limnology & Oceanography. 55 (2), 789-802 (2010).
  12. Dong, L. F., et al. Dissimilatory reduction of nitrate to ammonium, not denitrification or anammox, dominates benthic nitrate reduction in tropical estuaries. Limnology & Oceanography. 56 (1), 279-291 (2011).
  13. Fernandes, S. O., Bonin, P. C., Michotey, V. D., Garcia, N., LokaBharathi, P. A. Nitrogen-limited mangrove ecosystems conserve N through dissimilatory nitrate reduction to ammonium. Scientific Reports. 2, 419 (2012).
  14. Behrendt, A., de Beer, D., Stief, P. Vertical activity distribution of dissimilatory nitrate reduction in coastal marine sediments. Biogeosciences. 10 (11), 7509-7523 (2013).
  15. Song, G. D., Liu, S. M., Marchant, H., Kuypers, M. M. M., Lavik, G. Anammox denitrification and dissimilatory nitrate reduction to ammonium in the East China Sea sediment. Biogeosciences. 10 (11), 6851-6864 (2013).
  16. Yin, G., Hou, L., Liu, M., Liu, Z., Gardner, W. S. A novel membrane inlet mass spectrometer method to measure 15NH4+15+ for isotope-enrichment experiments in aquatic ecosystems. Environmental Science & Technology. 48 (16), 9555-9562 (2014).
  17. Zheng, Y., et al. Tidal pumping facilitates dissimilatory nitrate reduction in intertidal marshes. Scientific Reports. 6, 21338 (2016).
  18. Bu, C., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium in the Yellow River Estuary: Rates, Abundance, and Community Diversity. Scientific Reports. 7, 6830 (2017).
  19. Scott, J. T., McCarthy, M. J., Gardner, W. S., Doyle, R. D. Denitrification, dissimilatory nitrate reduction to ammonium, and nitrogen fixation along a nitrate concentration gradient in a created freshwater wetland. Biogeochemistry. 87 (1), 99-111 (2008).
  20. Shan, J., et al. Dissimilatory Nitrate Reduction Processes in Typical Chinese Paddy Soils: Rates, Relative Contributions, and Influencing Factors. Environmental Science & Technology. 50 (18), 9972-9980 (2016).
  21. Silver, W. L., Herman, D. J., Firestone, M. K. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium in upland tropical forest soils. Ecology. 82 (9), 2410-2416 (2001).
  22. Holmes, R. M., McClelland, J. W., Sigman, D. M., Fry, B., Peterson, B. J. Measuring 15N–NH4+ in marine, estuarine and fresh waters: An adaption of the ammonia diffusion method for samples with low ammonium concentrations. Marine Chemistry. 60 (3-4), 235-243 (1998).
  23. Sigman, D. M., et al. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater. Analytical Chemistry. 73 (17), 4145-4153 (2001).
  24. Weigand, M. A., Foriel, J., Barnett, B., Oleynik, S., Sigman, D. M. Updates to instrumentation and protocols for isotopic analysis of nitrate by the denitrifier method. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (12), 1365-1383 (2016).
  25. Isobe, K., et al. Analytical techniques for quantifying 15N/14N of nitrate, nitrite, total dissolved nitrogen and ammonium in environmental samples using a gas chromatograph equipped with a quadrupole mass spectrometer. Microbes and Environments. 26 (1), 46-53 (2011).
  26. Miyajima, T., Tanaka, Y., Koile, Y. Determining 15N enrichment of dissolved organic nitrogen in environmental waters by gas chromatography/negative-ion chemical ionization mass spectrometry. Limnology and Oceanography. 3 (3), 164-173 (2005).
  27. Stevens, R. J., Laughlin, R. J., Burns, L. C., Arah, J. R. M., Hood, R. C. Measuring the contributions of nitrification and denitrification to the flux of nitrous oxide from soil. Soil Biology and Biochemistry. 29 (2), 139-151 (1997).
  28. Porubsky, W. P., Velasquez, L. E., Joye, S. B. Nutrient-replete benthic microalgae as a source of dissolved organic carbon to coastal waters. Estuaries and Coasts. 31 (5), 860-876 (2008).
  29. Huygens, D., et al. Mechanisms for retention of bioavailable nitrogen in volcanic rainforest soils. Nature Geoscience. 1 (8), 543-548 (2008).
  30. Rutting, T., Boeckx, P., Muller, C., Klemedtsson, L. Assessment of the importance of dissimilatory nitrate reduction to ammonium for the terrestrial nitrogen cycle. Biogeosciences. 8 (7), 1779-1791 (2011).
  31. Song, B., Lisa, J. A., Tobias, C. R. Linking DNRA community structure and activity in a shallow lagoonal estuarine system. Frontiers in Microbiology. 5, 460 (2014).
  32. Cheng, L., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes in sediments of urban river networks: Spatiotemporal variations and environmental implications. Environmental Pollution. 219, 545-554 (2016).
  33. Lisa, J. A., Song, B., Tobias, C. R., Hines, D. E. Genetic and biogeochemical investigation of sedimentary nitrogen cycling communities responding to tidal and seasonal dynamics in Cape Fear River Estuary. Estuarine, Coastal and Shelf Science. 167, A313-A323 (2015).
  34. Deng, F. Y., et al. Dissimilatory nitrate reduction processes and associated contribution to nitrogen removal in sediments of the Yangtze Estuary. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 120 (8), 1521-1531 (2015).
  35. Tiedje, J. M., Zehnder, A. J. B. . Biology of Anaerobic Microorganisms. , 179-244 (1988).
  36. Tiedje, J. M., Sexstone, A. J., Myrold, D. D., Robinson, J. A. Denitrification: ecological niches, competition and survival. Antonie van Leeuwenhoek. 48, 569-583 (1982).
  37. Hardison, A. K., Algar, C. K., Giblin, A. E., Rich, J. J. Influence of organic carbon and nitrate loading on partitioning between dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and N2 production. Geochimica et Cosmochimica Acta. , 164 (2015).
  38. Sigman, D. M., et al. Natural abundance-level measurement of the nitrogen isotopic composition of oceanic nitrate: an adaptation of the ammonia diffusion method. Marine Chemistry. 57 (3-4), 227-242 (1997).
  39. Risgaard-Petersen, N., Rysgaard, S., Revsbech, N. P. Combined microdiffusion-hypobromite oxidation method for determining nitrogen-15 isotope in ammonium. Soil Science Society of America Journal. 59 (4), (1995).
  40. Gardner, W. S., Bootsma, H. A., Evans, C., John, P. A. S. Improved chromatographic analysis of 15N:14N ratios in ammonium or nitrate for isotope addition experiments. Marine Chemistry. 48 (3-4), 271-282 (1995).

Play Video

Cite This Article
Kuroiwa, M., Fukushima, K., Hashimoto, K., Senga, Y., Sato, T., Katsuyama, C., Suwa, Y. Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O. J. Vis. Exp. (164), e59562, doi:10.3791/59562 (2020).

View Video