本文的目的是描述从培养的粘附细胞中提取水代谢物的方案, 用于代谢组学分析, 特别是毛细管电泳质谱法。
代谢组学分析是一种很有前途的组学方法, 不仅可以了解癌细胞与正常细胞相比的特定代谢调节, 而且可以识别早期癌症检测和化疗反应预测的生物标志物。癌症患者。为代谢组学分析制备均匀样品是一个有待解决的关键问题。在这里, 我们提出了一个简单可靠的方案, 提取水代谢物从培养的粘附细胞代谢组学分析使用毛细管电泳质谱 (CE-MS)。通过培养和清洗细胞、用甲醇处理细胞、提取代谢物、用自旋柱去除蛋白质和大分子进行 CE-MS 分析, 对培养细胞的水代谢物进行分析。使用用氧化试剂—-二胺治疗的肺癌细胞系—-的代表性结果, 说明了细胞在氧化应激下明显可观察到的代谢转移。本文对参与代谢组学研究的学生和研究人员特别有价值, 他们是从细胞系中收获代谢物的新手, 由 CE-MS 进行分析。
奥托沃伯格观察到, 癌细胞获得了不寻常的能力, 吸收葡萄糖并发酵它, 在有足够氧气的情况下产生乳酸–这种现象被称为 warburg 效应或好氧糖酵解1,2。线粒体呼吸缺陷被推测为癌细胞有氧糖酵解的基础3。事实上, 沃堡效应是氟脱氧葡萄糖 (fdg)-正电子发射断层扫描 (pet) 肿瘤成像的基础, 在临床实践中广泛使用 4,5。高的有氧糖酵解率被认为是癌症的一个关键特征, 最近被采纳为著名的 “癌症特征” 之一, 正如 D. Hanahan 和 B. Weinberg6所描述的那样。癌基因和肿瘤抑制基因的体细胞突变–如hras/kras/nras、 egfr、 braf、myc、 tp53、异氰酸酯脱氢酶 (idh) 和富马酸水合酶 ( fh))–与癌细胞的特定代谢变化有关, 相信这是沃堡效应7的结果.
代谢组学分析是一种很有希望的方法, 不仅可以了解癌细胞的代谢调节, 而且可以识别早期癌症生物标志物和化疗反应预测。在用抗癌化合物治疗敏感或耐药癌细胞后, 跟踪其代谢反应有助于识别代谢生物标志物, 以预测特定抗癌疗法在癌症患者中的有效性8 , 9,10,11。本文将用二胺处理的 Egfr 突变从肺腺癌中提取的癌细胞系作为代谢分析模型。这种使用毛细管电泳质谱 (ce-ms) 的分析方法的优点是它对质量范围为 50-1000 12,13的带电代谢物进行了综合测量。本文的目的是为新手提供一个详细的逐步视觉方案, 用于从培养的癌细胞中制备水代谢物和随后的代谢组学分析, 特别是通过 CE-MS。
在这里, 我们描述了一种广泛使用的方法, 用于制备培养的癌细胞中的代谢物, 用于基于 cer-ms 的代谢组学分析。该方案中最关键的一点是癌细胞的适当准备, 因为测量的代谢物浓度被归一化到活细胞的数量。为了准确估计细胞数量, 有必要为每个实验组准备至少一个额外的培养皿, 以便在提取代谢物的同时计算活细胞的数量, 从而进行代谢分析。此外, 在每一道菜中, 为复制的细胞和用于计数的盘子中播种的细胞数量也应相同;在未来, 这将有助于快速和无压力 (例如, 无色氨酸) 细胞计数协议, 允许相同的菜数与活细胞和提取代谢物。在清洗过程中, 应注意, 以免细胞脱离盘子表面。严重的细胞毒性试验和其他减少细胞粘附的实验可能不适合这种提取协议, 因为在清洗过程中细胞可能会丢失。
使用5% 甘露醇溶液作为从培养细胞中提取代谢物的洗涤缓冲液非常重要, 因为基于盐的缓冲液 (如 PBS) 会干扰代谢组学分析并对测量产生不利影响。
两到三个菜可以结合成一个单一的样本, 通过单独提取代谢物从每个菜品, 然后汇集样本;然而, 结合多个菜肴往往会增加提取的代谢物溶液中残留的甘露醇。这也可能干扰 CE-MS 的代谢组学分析, 因此, 建议不要使用多个盘子或水井作为单个样品。
利用 CE-MS 的代谢组学分析方法已经开发出来, 用于分子量在50至1000达之间的带电分子的综合测量;因此, 该协议针对水、低分子量化合物的提取进行了优化。因此, 该方案不适合提取疏水代谢物, 如脂类或大分子, 如蛋白质和核酸。由于对培养细胞样品进行全面脂质分析或脂质体组学的需求日益增加, 因此需要制定一种简单有效的方案, 同时提取亲水性和疏水性代谢物。
代谢物提取的第一步–吸入培养基和用甘露醇清洗细胞–应尽快进行, 以最大限度地减少细胞代谢状况的变化。用甘露醇洗涤后用甲醇处理细胞被认为是变性蛋白, 从而防止酶催化进一步的代谢反应。然而, 即使经过甲醇处理, 也可能发生非酶化学反应–如氧化还原反应、一些脱羧过程和硫醇连接。因此, 对本议定书所衡量的这些反应中涉及的任何代谢物浓度都应谨慎解释。与基因组或转录组不同的是, 代谢组由具有多种化学性质的分子组成;因此, 没有一个单一的协议可以提取所有代谢物而不造成任何损失或干扰。为了更准确地测量这种高反应代谢物, 应参考专门为提取某些代谢物群体而设计的协议, 该方案需要分馏和衍生。然而, 这里介绍的协议描述了一种简单而快速地从培养的细胞样品中提取水代谢物, 以便通过 CE-MS 进行代谢组学分析。在本文中, 我们无法详细描述如何建立 CE-MS, 因为目前手稿的重点不同, 但是, 描述建立 CE-MS 的详细步骤可能需要单独的专门文章。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢索奈地区产业促进中心的所有成员的帮助。这项工作得到了山形县和鹤冈市研究基金、国家癌症中心研究和发展基金 [28-A-9号赠款] 和日本科学促进会 KAKENHI [赠款号码] 的部分支持。17K07189] 到 HM。
Automated cell counter | Thermo Scientific | AMQAX1000 | Countess II automated cell counter |
Automatic integration software | Agilent Technologies | MassHunter G3335-60041 | version B.02.00 |
CE system | Agilent Technologies | Agilent 7100 CE system | |
CE/MS adapter kit | Agilent Technologies | G1603A | |
CE-ESI-MS Sprayer kit | Agilent Technologies | G1607A | |
Cell counting chamber slide | Thermo Scientific | C10282 | Countess cell counting chamber slides |
Centrifugal filter device, 5 kDa | Human Metabolome Technologies | ULTRAFREE MC PLHCC, UFC3LCCNB-HMT | |
Conical sterile polypropylene tube, 15 ml | Thermo Scientific | N339651 | |
Conical sterile polypropylene tube, 50 ml | Thermo Scientific | N339653 | |
Costar stripette, 10 ml | Corning | 4488 | |
Costar stripette, 5 ml | Corning | 4487 | |
D(-)-Mannitol | Wako | 133-00845 | 500 g |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3301-1001 | for cation analysis |
Electrophoresis buffer | Human Metabolome Technologies | H3302-1021 | for anion analysis |
Fetal bovine serum | Biowest | S1780 | |
Filter tip, 1000 μl | Watson | 124P-1000S | |
Filter tip, 20 μl | Watson | 124P-20S | |
Filter tip, 200 μl | Watson | 1252-703CS | |
Fused silica capillary | Polymicro Technologies | TSP050375 | 50 μm i.d. × 80 cm total length |
HCC827 | American Type Culture Collection | CRL-2868 | |
Internal standard solution | Human Metabolome Technologies | H3304-1002 | |
Isocratic pump | Agilent Technologies | Agilent 1100 Series Isocratic Pump | |
Methanol | Wako | 138-14521 | 1 L, LC/MS grade |
Microtube, 1.5 ml | Watson | 131-415C | |
Operating Software | Agilent Technologies | ChemStation G2201AA | version B.03.01 for CE |
PC-9 | RIKEN Bio Resource Center | RCB4455 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
Sterile tissue culture dish, 100 mm | Corning | 430167 | |
Time-of-flight mass spectrometer | Agilent Technologies | Agilent G1969A Time-of-Flight LC/MS | |
Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Scientific | T10282 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049-100ML | |
Ultrapure water | Merck | Milli-Q water | 18.2 MΩ・cm pure water |
Volumetric flask, 50 ml | Iwaki | 5640FK50E | TE-32 |