Summary

Monitoreo de la Colonización Y Mantenimiento Bacterial en Arabidopsis thaliana Roots en un Sistema Hidropónico Flotante

Published: May 28, 2019
doi:

Summary

Aquí describimos un ensayo de crecimiento de plantas hidropónicas para cuantificar la presencia de especies y visualizar la distribución espacial de bacterias durante la colonización inicial de las raíces vegetales y después de su transferencia a diferentes ambientes de crecimiento.

Abstract

Las bacterias forman microbiomas complejos de rizoesfera según los microbios que interactúan, los organismos más grandes y el entorno abiótico. En condiciones de laboratorio, la colonización de la rizosfera por bacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPB) puede aumentar la salud o el desarrollo de plantas anfitrionas en relación con las plantas no colonizadas. Sin embargo, en entornos de campo, los tratamientos bacterianos con PGPB a menudo no proporcionan beneficios sustanciales a los cultivos. Una explicación es que esto puede deberse a la pérdida del PGPB durante las interacciones con microbios del suelo endógenos durante la vida útil de la planta. Esta posibilidad ha sido difícil de confirmar, ya que la mayoría de los estudios se centran en la colonización inicial en lugar del mantenimiento de pgPB dentro de las comunidades rizosferas. Se presume aquí que el montaje, la coexistencia y el mantenimiento de las comunidades bacterianas están moldeados por características deterministas del microambiente de la rizoesfera, y que estas interacciones pueden afectar la supervivencia de PGPB en entornos nativos. Para estudiar estos comportamientos, se optimiza un ensayo hidropónico de crecimiento vegetal utilizando Arabidopsis thaliana para cuantificar y visualizar la distribución espacial de bacterias durante la colonización inicial de las raíces vegetales y después de la transferencia a un crecimiento diferente Entornos. La reproducibilidad y utilidad de este sistema se validan con el bien estudiado PGPB Pseudomonas simiae. Para investigar cómo la presencia de múltiples especies bacterianas puede afectar a la dinámica de colonización y mantenimiento en la raíz de la planta, una comunidad modelo a partir de tres cepas bacterianas (una Arthrobacter, Curtobacteriumy Microbacterium especies) originalmente aisladas de la rizoesfera A. thaliana. Se ha demostrado que la presencia de estas diversas especies bacterianas se puede medir utilizando este ensayo hidropónico de mantenimiento de plantas, que proporciona una alternativa a los estudios comunitarios bacterianos basados en la secuenciación. Estudios futuros utilizando este sistema pueden mejorar la comprensión del comportamiento bacteriano en microbiomas de plantas multiespecie con el tiempo y en condiciones ambientales cambiantes.

Introduction

La destrucción de cultivos por enfermedades bacterianas y fúngicas da lugar a una menor producción de alimentos y puede perturbar gravemente la estabilidad mundial1. Sobre la base del descubrimiento de que los microbios en suelos supresores son responsables de aumentar la salud vegetal2, los científicos han preguntado si el microbioma vegetal puede ser aprovechado para apoyar el crecimiento de las plantas modificando la presencia y abundancia de particulares especies bacterianas3. Las bacterias que se encuentran para ayudar en el crecimiento o desarrollo de las plantas se denominan colectivamente bacterias que promueven el crecimiento de las plantas (PGPB). Más recientemente, los estudios han pasado de identificar simplemente el PGPB potencial a entender cómo las interacciones interkingdom en el suelo, alrededor de las raíces o en la rizosfera (el área que rodea directamente e incluye la superficie de la raíz) pueden estar afectando a PGPB actividad4.

La colonización rizosfera por PGPB puede aumentar la salud o el desarrollo de las plantas anfitrionas en respuesta a diversos factores estresantes en relación con las plantas no colonizadas5. Sin embargo, los resultados son a menudo más variables en las condiciones del suelo nativo en comparación con los observados en los invernaderos y entornos de laboratorio estrechamente controlados6. Una hipótesis para esta diferencia es que el crecimiento o comportamiento de PGPB puede ser inhibido por bacterias o hongos de suelo nativo en los campos7,8. Los efectos beneficiosos de las bacterias rizosfera generalmente dependen de la capacidad de las bacterias a 1) localizar y moverse hacia la raíz, 2) colonizar la raíz a través de la formación de biopelículas, y 3) interactuar con la planta huésped o patógenos a través de la producción de moléculas pequeñas metabolitos7,9. Cualquiera de estos comportamientos de colonización puede verse afectado por la presencia y actividad de los microbios vecinos10.

Diseñamos un sistema para cuantificar y visualizar estas distintasetapas de colonización bacteriana de la rizoesfera (Figura 1). Este enfoque facilitará los estudios que investigan por qué a veces no se observa el mantenimiento a largo plazo de la PGPB después de la transferencia de plantas a nuevos ambientes, como durante la plantación de plántulas preinoculadas. Arabidopsis thaliana como fueron elegidos como modelo de planta debido a su amplio uso en estudios de laboratorio, así como a los amplios datos disponibles sobre sus interacciones microbianas11. Hay tres etapas en el sistema: 1) A. crecimiento thaliana, 2) colonización bacteriana, y 3) mantenimiento bacteriano (ver Figura 1). Debido a que A. thaliana es una planta terrestre, era importante asegurarse de que no estaba sufriendo estrés hídrico indebido en el sistema hidropónico12. Inspirados en los métodos utilizados por Haney et al.13, las plántulas se cultivan en malla de plástico para separar el brote del medio de crecimiento líquido. Este sistema no parece comprometer la salud y el desarrollo del huésped de la planta, y mejora el crecimiento de A. thaliana en líquido11. A medida que el brote de la planta flota sobre la superficie, las raíces están completamente expuestas a la colonización por bacterias inoculadas en el medio de crecimiento bacteriano líquido. Esto permite que las bacterias de interés sean examinadas para la colonización de nutrientes que son más propicios para el crecimiento, mientras que luego cambia las condiciones para permitir que la planta continúe creciendo en un medio nutritivo diseñado para apoyar su crecimiento. Ambas etapas incluyen temblores constantes para prevenir la anoxia de la raíz13. Las bacterias se pueden visualizar o cuantificar desde las raíces de la planta después de la transferencia desde el medio de colonización o el medio de mantenimiento. Este sistema hidropónico es muy flexible, permitiendo que las condiciones experimentales y las tensiones aplicadas se alteren fácilmente dependiendo de los intereses de los investigadores.

Este método descrito es importante en el contexto del cuerpo más amplio de literatura sobre las interacciones entre la planta y los microbios, ya que proporciona un sistema robusto para estudiar estas interacciones en la superficie de la raíz, al mismo tiempo que es personalizable a las preferencias de crecimiento de diferentes bacterias. Los laboratorios de biología vegetal a menudo realizan experimentos de colonización de microbios vegetales en agar sólido, lo que permite sólo el movimiento plano (si eso) de bacterias, al tiempo que requiere la manipulación potencialmente destructiva de las plantas durante la transferencia posterior. Por el contrario, los laboratorios de microbiología han priorizado con frecuencia la salud de las bacterias dentro de sus experimentos, en detrimento de las plantas14,15. Estas diferentes prioridades de los laboratorios centrados en plantas y microbiología han hecho históricamente difícil comparar resultados entre estos grupos, ya que cada uno suele optimizar las condiciones experimentales para optimizar su organismo de interés15. El sistema de crecimiento de plantas de malla flotante descrito aquí previene la inmersión completa de la planta, una ventaja notable para estudios anteriores orientados a la microbiología, al tiempo que optimiza temporalmente el crecimiento y la supervivencia de las bacterias para facilitar la colonización. Por lo tanto, el ensayo que presentamos aquí puede abordar las preocupaciones de ambos biólogos de plantas (sobre la sobrehidratación y la manipulación táctil de la planta) al tiempo que satisface los criterios de los microbiólogos (permitiendo diferentes condiciones de crecimiento bacteriano y múltiples interacciones de especies)7. Este protocolo está diseñado para ser adaptable para su uso con diversas bacterias, plantas y condiciones ambientales.

Protocol

NOTA: La configuración experimental se describe para mayor claridad y se utiliza para generar los resultados representativos incluidos en este informe, pero las condiciones se pueden modificar según se desee. Todos los pasos deben realizarse utilizando EPI y siguiendo las recomendaciones institucionales y federales para la seguridad, de acuerdo con el estado BSL de las bacterias utilizadas. 1. Caracterización de bacterias Determinar la morfología de las bacterias en la placa de a…

Representative Results

El bien caracterizado PGPB P. simiae WCS417r es conocido por colonizar las raíces de A. thaliana en el cultivo hidropónico. Esta bacteria naturalmente fluorescente se puede visualizar fácilmente mediante microscopía en las raíces de las plántulas después de la colonización (Figura2). Aunque es posible imaginar toda la longitud de estas semilleras A. thaliana’ (4-6 mm de longitud) raíces, hacerlo para muchas plantas tomaría…

Discussion

Las plantas en todos los ambientes interactúan con miles a millones de diferentes bacterias y hongos5,7. Estas interacciones pueden afectar negativa y positivamente a la salud de las plantas, con efectos potenciales sobre el rendimiento de los cultivos y la producción de alimentos. Los trabajos recientes también sugieren que la colonización variable de cultivos por PGPB puede explicar el tamaño impredecible de la planta y el rendimiento de los cultivos en lo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por fondos de investigación proporcionados por el Departamento de Investigación Biológica y Ambiental Energética (DOE-BER 0000217519 a E.A.S.), la Fundación Nacional de Ciencias (INSPIRE IOS-1343020 a E.A.S).. SLH también fue apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias. Agradecemos al Dr. Jeffery Dangl por proporcionar cepas bacterianas y una visión invaluable. Agradecemos al Dr. Andrew Klein y Matthew J. Powers por sus sugerencias experimentales. Por último, SLH desea agradecer a las conexiones en las redes sociales por recordarnos que la difusión de la ciencia es un privilegio y una responsabilidad, especialmente a través de medios creativos y accesibles.

Materials

Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes any N/A
24-well plates BD Falcon 1801343
Aeraseal Excel Scientific BE255A2
Autoclave any N/A
Bacteria of Interest any N/A Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred
BactoAgar BD 2306428; REF 214010
bleach any N/A
Conviron any N/A Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic any N/A
Ethanol any N/A
Flame any N/A
Forceps any N/A
Incubator any N/A At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid any N/A
Lennox LB Broth RPI L24066-1000.0
Microcentrifuge any N/A
Micropipetters any N/A Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence) any N/A Could be light if best definition not important
MS Salts + MES RPI M70300-50.0
Orbital Plate Shaker any N/A Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes any N/A 50 mL total volume
Reservoirs any N/A
Spectrophotometer any N/A
Standard Hole Punch any N/A Approximately 7mm punch diameter
Sterile water any N/A
Surgical Tape 3M MMM1538-1
Teflon Mesh McMaster-Carr 1100t41
Ultrasonicator any N/A
Vortex Mixer any N/A
X-gal GoldBio x4281c other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment any N/A For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II Excel Scientific FE124F
Glass beads any N/A
Multipetter/Repetter any N/A
Sterile 96-well plates any N/A For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds any N/A We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017

References

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Cite This Article
Harris, S. L., Pelaez, C. A., Shank, E. A. Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System. J. Vis. Exp. (147), e59517, doi:10.3791/59517 (2019).

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