Новый метод пробоподготовки была разработана для размещения клеток и тканей coculture обнаружить малые молекулы exchange с помощью тепловизионных масс-спектрометрии.
Imaging масс-спектрометрия (IMS) регулярно был применен для трех типов образцов: разделов ткани, сфероидов и микробных колоний. Эти типы образцов были проанализированы с использованием матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации время полета масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS) для визуализации распределения белки, липиды и метаболитов через биологический образец интерес. Мы разработали метод подготовки Роман образца, который сочетает в себе сильные стороны трех предыдущих приложений для решения underexplored подход к выявлению химическая связь в рак, путем посева культуры mammalian клеток в агарозы в coculture с здоровые ткани, после высыхания образца. У млекопитающих ткани и клетки cocultured в непосредственной близости, позволяя химическая связь через диффузии между ткани и клетки. В определенное время точках образца на основе агарозы высушена таким же образом как микробной колоний, подготовленный для анализа IMS. Наш метод был разработан для модели связи между высококачественного Серозный рак яичников, производный от маточной трубе, как он взаимодействует с яичника во время метастазов. Оптимизация подготовки пробы привело к идентификации норадреналин как ключевого химического компонента в яичников микроокружения. Этот недавно разработанный метод может применяться для других биологических систем, которые требуют понимания химической связи между соседними клетки или ткани.
Imaging масс-спектрометрия (IMS) был оптимизирован для характеризовать пространственное распределение молекулярных компонентов в три широко используемых приложений: фрагменты тканей, сфероидов и микробных колоний1,2,3. Фрагменты тканей могут использоваться для оценки локализации метаболитов в контексте биологических условий в узле, либо целевых или нецелевого в пределах определенного диапазона массы. Однако различия между молекулярные особенности являются наиболее значительных и очевидно здоровых тканей по сравнению с больными условие, например, опухоль. Этот подход IMS особенно приспособлены для обнаружения болезни биомаркеров, однако, получение образцов тканей на отдельных стадиях прогрессирования заболевания (например, опухоль классы) исключает возможность идентификации сигналов, которые могут быть важны для инициирования болезни. Обмен информацией через пространство является вездесущий особенностью многих биологических систем, и кусочки ткани не может захватить этот динамический химических реле. Один из методов, который способен визуализации химического обмена и распространения является IMS микробной колоний, выращенных на плитах агара; малые молекулы способны распространять через и через агар и может быть захвачен через матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации (MALDI-TOF) масс-спектрометрии4. Этот рост установки может использоваться для идентификации молекул, обмениваются дискретных биологических образований (колоний) и также может определить направленность производства метаболит. Платформа, первоначально разработанный для роста микроорганизмов колонии была адаптирована к изучить первичный метаболизм эксплантов ткани, выросло с mammalian клеток, и МСМ была использована для оценки динамического химического обмена в системе экстракорпорального млекопитающих.
В последние несколько лет стало ясно, что высокий класс Серозный рак яичников (HGSOC) часто происходит в маточной трубе эпителия (FTE) и затем метастазирует в яичнике во время ранних заболеваний развития5,6, 7 , 8. Причина, что онкогенной FTE клетки распространились на яичнике, где большие опухоли в конечном итоге формируют и далее метастазировать, в настоящее время непонятно. Предыдущие исследования были направлены на роль яичников белков в первичной метастазирования яичников; Однако недавно было продемонстрировано что переход от здоровой онкогенной ткани приводит к массовым нарушения клеточного метаболизма и изменяет производство малых молекул9,10,11. Таким образом мы предположили, что малые молекулы, обмениваются ФТЕ и яичника может быть частично отвечает за основной метастазов HGSOC.
С помощью нашего недавно разработанные процедуры IMS, мы определили, что coculture онкогенной FTE и здоровой ткани яичника индуцирует производства норадреналина из яичника. Однако другие типы клеток или нормальные клетки ФТЕ не вызывают этот эффект. Чрезвычайный преимущество этого метода является, что могут быть визуализированы молекулярного производства и обмена сигналами, которые представляют реальных молекул, так что даже в coculture это можно определить источник сигнала. Это преимущество над анализ гомогенизированных образцов, где все пространственная информация теряется. В нашей модели системы мы смогли четко назначить производства норадреналина в яичнике. Норадреналина связано с метастазами и chemoresistance рака яичников, и наши обнаружения этой молекулы проверила, что метод Роман IMS может раскрыть биологически соответствующих молекул12,13, 14. Эта проверка позволяет нам предложить, что это новое применение IMS может быть особенно полезно для исследовательских групп, которые пытаются определить малых молекул в coculture средах и понять раннего события, влияющие ячейки преобразования и метастаз. Общая цель этого метода заключается в том, для выяснения личности и пространственного распределения мелких молекул во время обмена между тканей и органов, представлены в vitro 3D клеточных культур или ex vivo ткани.
Существует растущее число доказательств того, что подразумевает норадреналина в роль в HGSOC12,17,18, и этот метод вносит более механистических информации. С по меньшей мере восемь биологических условиях на тот же слайд метод можно объяснит…
The authors have nothing to disclose.
Финансирование было предоставлено Чикаго биомедицинских консорциум с поддержкой от Searle фондов в Чикаго по общинным (C-076) (L.M.S.); Университет Иллинойса в Чикаго запуска средства (L.M.S.); Грант 543296 из Альянса Фонд исследований рака яичников (M.D.); и UG3 ES029073 (J.E.B.) и национальным центром для продвижения трансляционная наук, Национальный институт здравоохранения, через Грант UL1TR002003 (Джеб и LMS).
15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |