Summary

VirWaTest, eine Point-of-Use-Methode zum Nachweis von Viren in Wasserproben

Published: May 11, 2019
doi:

Summary

Hier stellen wir VirWaTest vor, eine einfache, erschwingliche und tragbare Methode zur Konzentration und Detektion von Viren aus Wasserproben am Einsatzort.

Abstract

Viren, die von Menschen und Tieren ausgeschieden werden, können Wasserquellen kontaminieren und eine Gefahr für die menschliche Gesundheit darstellen, wenn dieses Wasser zum Trinken, zur Bewässerung von Lebensmitteln, zum Waschen usw. verwendet wird. Der klassische Fäkalbakterienindikator überprüft nicht immer das Vorhandensein viraler Krankheitserreger, so dass der Nachweis viraler Krankheitserreger und Viralindikatoren relevant ist, um Maßnahmen zur Risikominderung zu ergreifen, insbesondere in humanitären Szenarien und in Gebieten. wo wasserübertragene Virusausbrüche häufig auftreten.

Derzeit stehen mehrere kommerzielle Tests zur Quantifizierung von Fäkalindikatorbakterien (FIB) zur Prüfung am Einsatzort zur Verfügung. Solche kommerziellen Tests sind jedoch nicht für den Nachweis von Viren verfügbar. Der Nachweis von Viren in Umweltwasserproben erfordert die Konzentration mehrerer Liter auf kleinere Volumina. Darüber hinaus beruht der Nachweis von Viren, sobald es konzentriert ist, auf Methoden wie nukleinsäureextraktion und molekularer Detektion (z. B. Polymerase-Kettenreaktion [PCR]-basierte Assays) der viralen Genome.

Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Konzentration von Viren aus 10 L Wasserproben sowie die Extraktion von viralen Nukleinsäuren am Einsatzort mit einfachen und tragbaren Geräten. Dies ermöglicht die Prüfung von Wasserproben am Einsatzort für mehrere Viren und ist in humanitären Szenarien sowie in jedem Kontext nützlich, in dem kein ausgestattetes Labor zur Verfügung steht. Alternativ ermöglicht die Methode die Konzentration von Viren in Wasserproben und den Versand des Konzentrats an ein Labor bei Raumtemperatur zur weiteren Analyse.

Introduction

In den ersten Phasen humanitärer Notfälle sind der Zugang zu sauberer Wasserversorgung, sanitären Einrichtungen und Hygiene für das Überleben der Betroffenen von entscheidender Bedeutung. Daher ist die Überwachung der Wasserqualität eine Priorität, um Ausbrüche auf dem Wasser zu verhindern. Es ist allgemein bekannt, dass kontaminiertes Wasser häufig der Ursprung von Krankheiten ist, aber es ist oft schwierig, die Quellen von Virusausbrüchen wie dem Hepatitis-E-Virus (HEV) zu bestimmen, selbst wenn herkömmliche Labormethoden zur Verfügung stehen. Die Kontrolle der Wasserqualität basiert auf der Quantifizierung von FIB1,2,3,4. Es wurde jedoch ausführlich dokumentiert, dass es keinen Zusammenhang zwischen dem Fehlen von FIB und dem Vorhandensein von viralen, wasserübertragenen Krankheitserregern wie Rotavirus (RoV), Norovirus (NoV) oder HEV5,6gibt. Daher kann die Verwendung der auf FIB basierenden Wasserqualitätskriterien zu einer Unterschätzung der Risiken führen, die mit dem Vorhandensein von wasserbasierten Viruserregern verbunden sind. Die Überwachung von Indikatorviren wie humanen Adenoviren (HAdV) oder spezifischen Krankheitserregern wäre hilfreich bei der Definition der Exposition gegenüber virusviralen Krankheitserregern und der Identifizierung der potenziellen Quelle einer infektion beim Menschen7,8, 9,10 und bei der Validierung der Wirksamkeit von sanitären Maßnahmen11.

Bisher beruhte der Nachweis von Viren in diesen Szenarien auf qualifiziertes Personal und komplexe Logistik. VirWaTest (virwatest.org) zielt auf die Entwicklung einer einfachen, erschwinglichen und tragbaren Methode zur Konzentration und anschließenden Detektion von Viren aus Wasserproben am Einsatzort ab.

Die Viruskonzentration basiert auf dem Prinzip der organischen Flockung von 10 L Wasserproben, durch die Viren in kleineren Bänden12,13zurückgewonnen werden. Die Flocken werden gesammelt und einem Puffer hinzugefügt, der die Viren liert und verhindert, dass die Nukleinsäuren abgebaut werden, wenn sie nicht mehr als 2 Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.

Die Nukleinsäureextraktionsmethode basiert auf der Verwendung von magnetischen Partikeln, an die die Nukleinsäuren adsorbiert werden. Sie können mit einer magnetischen Pipette, an die sich die Partikel anheften, von einem Waschpuffer in einen anderen und schließlich in den Elutionspuffer übertragen werden. Die erhaltenen viralen Nukleinsäuresuspensionen können an ein Referenzlabor geliefert werden, wo der Nachweis mit molekularen Methoden auf PCR-Basis durchgeführt werden kann. Für jede Nukleinsäureextraktion werden zwei verschiedene Mengen getestet, um eine enzymatische Hemmung, die von der Probe ausgeht, auszuschließen. Alternativ können bei minimaler Geräteverfügbarkeit PCR-Tests am Einsatzort durchgeführt werden. Der gesamte Prozess ist so konzipiert, dass er unabhängig von einem Netzteil durchgeführt wird (Abbildung 1).

Ein quantitativer PCR-Test zum Nachweis von HAdV, der vom Menschen ausgeschieden und in Abwasserproben in hohen Konzentrationen gefunden wurde, wurde angepasst, um am Einsatzort ausgeführt zu werden. HAdV werden als menschliche fäkalvirale Indikatoren verwendet. Eine PCR zur Quantifizierung von MS2-Bakteriophagen wurde ebenfalls angepasst, da MS2 in VirWaTest als Prozesskontrolle eingesetzt wird. Die Methode kann für die Erkennung von Viren von Interesse angepasst werden.

Nach der Entwicklung wurde die VirWaTest-Methode von den Anwendern in zwei verschiedenen Einstellungen in der Republik Zentralafrika (RCA) und Ecuador angewendet und gibt Feedback zur Anwendung des Protokolls in realen Situationen.

Unserer Kenntnis nach ist dies das erste Verfahren, das die Konzentration und Detektion von Viren am Einsatzort ermöglicht, unabhängig von stromversorgung, großen Geräten und Gefrier-/Kühlbedingungen. Es wird empfohlen, zwei Wiederholungen jeder Wasserprobe zu sammeln, um robuste Ergebnisse zu erzielen.

Protocol

1. Vorbereitung und Verpackung HINWEIS: Die zu verpackenden Materialien/Ausrüstungen sind in Tabelle 1aufgeführt. Verwenden Sie Handschuhe, um die für die Prozesskontrolle erforderlichen Reagenzien, die Konzentrationsreagenzien, die Nukleinsäureextraktionsreagenzien und die Nachweisreagenzien zu handhaben. Tragen Sie Schutzbrillen, um die reagenzien zu handhaben, die für die Nukleinsäureextraktion erforderlich sind. Prozesssteuerung V…

Representative Results

Methodenentwicklung Dieses Verfahren wurde im Labor für Viren Kontaminanten von Wasser und Lebensmitteln in Zusammenarbeit mit GenIUL und Oxfam Intermin entwickelt. Es besteht aus drei verschiedenen Schritten. Die erste, die virale Partikelkonzentration, ist eine Anpassung einer Magermilchflockungsmethode, die zuvor beschrieben wurde12,17,<su…

Discussion

Die VirWaTest-Methode ermöglicht die Konzentration von Viren und Nukleinsäureextraktion aus Wasserproben am Einsatzort von unerfahrenen Anwendern. Es ist ein erschwingliches, schnelles und einfaches Protokoll. Die Konzentration basiert auf dem Prinzip der organischen Flockung mit Magermilch, wodurch sich Magermilchproteine aufgrund des niedrigen pH- und hohen Leitfähigkeitswertes zu Flocken aggregieren lassen, die die Viren adsorbieren. Wenn die Flocken Sediment, ist es einfach, sie zu sammeln, so dass es möglich ist…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VirWaTest war ein Forschungsprojekt, das vom HIF (Humanitarian Innovation Funds) Programm der ELHRA (Enhancing Learning & Research for Humanitarian Assistance) finanziert wurde. Die Autoren würdigen die WASH-Teams, die freundlicherweise an dieser Studie mitgearbeitet haben. Die Analyse von Proben in Ecuador wurde von Oxfam Ecuador und Direccién de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT.17.01). S. Bofill-Mas ist Serra-Hunter Fellow an der Universität Barcelona.

Materials

5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) Solis BioDyne 08-14-00001 Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions
8-Microtube Strips with Caps dD Biolab 840637 Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR
Aquagenx CBT E. coli Kit Aquagenx, LLC ECCBT10 10 Tests per Kit
Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer GenIUL 900011674 Includes 12V car power adapter
Bucket Support GenIUL 900011648 Aluminium support
Bucket, 10 L Cater4You 10LTR Polypropilene, Tamperproof, Clear color
Centrifuge Tube, 50 mL LabBox CTSP-E50-050 Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt
Citric Acid 1-Hydrate, 500 g PanReac AppliChem 1410181211 Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram
Clear PET Bottle LabBox FPET-500-088 Clear Color, PET, Cap Not Included
Difco Skim Milk, 500 g Becton Dickinson 232100 Dehydrated
DNA/RNA Shield, 250 mL Zymo Research R1100-250 DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL
Easy9 Pipette Controller LabBox EAS9-001-001 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder
Eppendorf Tube, 0.5 mL Eppendorf 0030121023 Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 2 mL Eppendorf 0030120094 Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 5 mL dD Biolab 999542 Polypropylene, Sterile, Graduated
Ethanol 96% V/V, 1 L Panreac AppliChem 361085-1611 For UV, IR  and HPLC
Laboratory Tweezers LabBox FORS-007-002 Thin, Curved End, L= 120 mm
Magnetic Stirrer GenIUL 900017000 Battery-powered
Marker dD Biolab 929203 Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware
Micro Rota-Rack for Microtubes dD Biolab 37782 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm
Mini8 Real-Time PCR Cycler Coyote Biosciences, China Mini-8 Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes
NucliSens Lysis Buffer Biomerieux 200292 Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature
Open Tip Serological Pipette, 10 mL Deltalab 900136N Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)
PE Screw Cap PP28 LabBox TP28-004-020 For PET Bottles
pH Indicator Strip LabBox WSPH-001-001 Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack
Plastic Test Tube Quimikals 300913 Includes Cap
Polyethylene Pasteur Pipette LabBox PIPP-003-500 Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile
Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL Deltalab 409726 Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL
Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL Deltalab 409526G Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL
Powder Powder Detergent Regular Powder Soap for washing clothes
Power Cables for Magnetic Stirrer GenIUL 900011692 Connection between batteries and magnetic stirrers
QuickPick Magnetic Tool BioNobile 24001 Hand-held tool for magnetic particles
QuickPick Tips in Box BioNobile 24296 RNase-Free, Autoclaved, 96 Units
QuickPick XL gDNA Magnetic Particles BioNobile SN51100 3.2 mL
Sea Salts Sigma-Aldrich S9883-500G An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water
Silicone Tubing LabBox SILT-006-005 Roll of 5 Meters, Inner  ø x Outer  ø= 6 x 10 mm
Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 – 100.5% VWR Chemicals 28244295 Pellets, 1 Kg
Solar Rotary Platform SOL-EXPERT Group 70020 Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams
SOLIScript 1-step Probe Kit Solis BioDyne 08-57-00250 Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions
SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit BioTools 21.141-4197 Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer).
SpinBar Octhaedral Stirring Magnet dD Biolab 045926 Pivot Ring, L x  ø = 38 x 8 mm, Blue
Tape-End Serological Pipette, 10 mL Deltalab PN10E1 Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)
Tape-End Serological Pipette, 50 mL Deltalab 900043 Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)
Termi-DNA-Tor – Nucleic Acid Remover BioTools 22001-4291 Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL
Water Molecular Biology Reagent, 1L Sigma-Aldrich W4502-1L Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered
Whirl-Pak Bag, 540 mL Deltalab 200361 Stable bottom
Zip Lock Plain Bag LabBox BZIP-080-100 Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm

References

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Aguado, D., Fores, E., Guerrero-Latorre, L., Rusiñol, M., Martínez-Puchol, S., Codony, F., Girones, R., Bofill-Mas, S. VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples. J. Vis. Exp. (147), e59463, doi:10.3791/59463 (2019).

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