Este protocolo esboça um método para a análise quantitativa da formação complexa da proteína do mitofagia especificamente em pilhas beta das amostras preliminares do Islet humano. Esta técnica permite assim a análise da mitofagia do material biológico limitado, que são cruciais em amostras pancreatic humanas preciosas da pilha beta.
Mitophagy é uma via de controle de qualidade mitocondrial essencial, que é crucial para bioenergética de células beta de Islet pancreáticas para abastecer a liberação de insulina estimulada por glicose. A avaliação da mitophagia é desafiadora e muitas vezes requer repórteres genéticos ou múltiplas técnicas complementares não facilmente utilizadas em amostras de tecido, como as ilhotas pancreáticas primárias humanas. Aqui nós demonstramos uma aproximação robusta para visualizar e quantificar a formação de complexos endógenos principais do mitofagia em ilhotas pancreatic humanas preliminares. Utilizando a técnica sensível do ensaio da ligadura da proximidade para detectar a interação dos reguladores NRDP1 e USP8 de mitofagia, nós podemos quantificar especificamente a formação de complexos mitofagia essenciais in situ. Ao acoplar essa abordagem à contracepção para o fator de transcrição PDX1, podemos quantificar complexos de mitophagia, e os fatores que podem prejudicar a mitofagia, especificamente dentro das células beta. A metodologia que descrevemos supera a necessidade de grandes quantidades de extratos celulares necessários para outros estudos de interação proteína-proteína, como a imunoprecipitação (IP) ou espectrometria de massas, e é ideal para amostras de Islet humanas preciosas geralmente não disponíveis em quantidades suficientes para estas abordagens. Além disso, esta metodologia elimina a necessidade de técnicas de triagem de fluxo para purificar as células beta de uma população de Ilhéus heterogêneo para aplicações proteicas a jusante. Assim, nós descrevemos um protocolo valioso para o visualização do mitofagia altamente-compatível para o uso em populações heterogêneas e limitadas da pilha.
As células beta pancreáticas produzem a insulina necessária para manter a homeostase normal da glicose, e sua falha resulta no desenvolvimento de todas as formas de diabetes. As células beta mantêm uma capacidade mitocondrial robusta para gerar a energia necessária para o metabolismo da glicose de casal com liberação de insulina. Recentemente, tornou-se evidente que a manutenção da massa mitocondrial funcional é de importância crucial para a função de célula beta ideal1,2,3. A fim de sustentar a massa mitocondrial funcional, as células beta dependem de mecanismos de controle de qualidade para remover mitocôndrias disfuncionais, danificadas ou envelhecendo4. Nós e outros já demonstraram que as células beta dependem de uma forma especializada de rotatividade mitocondrial, chamada autofagia mitocondrial (ou mitophagy), para manter o controle de qualidade mitocondrial em ambos os roedores e ilhotas humanos1, 2,5. Infelizmente, entretanto, não havia nenhum método simples para detectar mitofagia, ou componentes mitofagia endogenamente expressados, em pilhas beta pancreatic humanas.
Nós mostramos recentemente que a regulação ascendente da mitofagia em beta Cells confia na formação de um complexo da proteína que compreende as ligases E3 CLEC16A e NRDP1 e o deubiquitinase USP81. NRDP1 e USP8 foram mostrados de forma independente para afetar a mitofagia através da ação no iniciador de mitofagia chave Parkin6,7. NRDP1 alvos Parkin para ubiquitinação e degradação para desligar mitofagia6, e USP8 especificamente deubiquitinates K6-lig Parkin para promover seu translocação à mitocôndria7. A tecnologia do ensaio da ligadura da proximidade (PLA) foi um avanço recente no campo da biologia8da interação da proteína, permitindo o visualização de interações endógenas da proteína in situ em únicas pilhas, e não é limitada pelo material escasso da amostra. Esta metodologia é particularmente atraente para a biologia de células de Islet/beta humana, devido à escassidade da disponibilidade da amostra, aliada à necessidade de compreensão de complexos proteicos fisiologicamente relevantes dentro de tipos de células heterogêneas.
Utilizando a aproximação do PLA, nós podemos observar complexos mitofagia endógenos chaves em pilhas beta pancreatic humanas preliminares e em linhas de pilha neuronal, e demonstramos os efeitos de um ambiente antidiabetogênico na via de mitofagia1. Em síntese, o objetivo geral deste protocolo é analisar complexos proteicos específicos de mitophagia em tecidos que não possuem material abundante, ou onde estudos convencionais de interação protéica não são possíveis.
Aqui nós descrevemos uma abordagem simples e eficiente para usar NRDP1: USP8 PLA em tecidos/células de interesse para quantificar a formação de complexos de mitofagia upstream. Nós confirmamos previamente a formação do complexo do mitofagia de CLEC16A-NRDP1-USP8 em pilhas beta pancreatic por diversas metodologias, incluindo experimentos da coimunoprecipitação, estudos Cell-Free da interação, e in vitro assim como o Cell-Based ensaios de ubiquitinação e demonstraram como esse complexo impulsiona o fluxo mitof…
The authors have nothing to disclose.
Os autores reconhecem o apoio ao financiamento da JDRF (CDA-2016-189 e SRA-2018-539), o Instituto Nacional de diabetes e doenças digestivas e renais, institutos nacionais de saúde (R01-DK-108921), a família Brehm e a família Anthony. O prêmio JDRF de desenvolvimento de carreira da S.A.S. é parcialmente apoiado pela Academia dinamarquesa de diabetes, que é apoiada pela Fundação Novo Nordisk.
0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
Fetal bovine serum | |||
Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
PR619 | Apex Bio | A812 | |
Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |