Summary

Conception de la ligation et de la perforation et de l'infection intranasale Double modèle de l'immunosuppression induite par la septicémie

Published: June 15, 2019
doi:

Summary

Ce protocole décrit des techniques pour mesurer les résultats infectieux sous-jacents aux infections secondaires nosocomiales dans l’état immunosuppresseur, d’abord en établissant des souris de ligature de cecal/perforation, puis en les défiant avec l’infection intranasale à créer un modèle cliniquement pertinent de septicémie d’immunosuppression.

Abstract

La septicémie, une infection grave et compliquée représentant un danger pour la vie, se caractérise par un déséquilibre entre les réponses pro et anti-inflammatoires dans plusieurs organes. Avec le développement de thérapies, la plupart des patients survivent à la phase hyperinflammatoire mais progressent vers une phase immunosuppressive, qui augmente l’émergence d’infections secondaires. Par conséquent, une meilleure compréhension de la pathogénie sous-jacente aux infections secondaires nosocomiales dans la phase immunosuppressive pendant le septicémie est d’une importance énorme. Rapporté ici est un modèle pour tester les résultats infectieux en créant des infections à double coup chez les souris. Une procédure chirurgicale standard est utilisée pour induire la péritonite polymicrobienne par ligature et perforation célérique (CLP) et suivie d’une infection intranasale de Staphylococcus aureus pour simuler la pneumonie se produisant dans la suppression immunitaire qui est fréquemment vu chez les patients septiques. Ce modèle double peut refléter l’état immunosuppresseur se produisant dans les patients présentant le sepsis prolongé et la susceptibilité à l’infection secondaire de la pneumonie nosocomial. Par conséquent, ce modèle fournit une approche expérimentale simple pour étudier la pathophysiologie de la pneumonie bactérienne secondaire induite par la septicémie, qui peut être utilisée pour découvrir de nouveaux traitements pour la septicémie et ses complications.

Introduction

La septicémie initie un jeu complexe des processus pro-inflammatoires et anti-inflammatoires de l’hôte et se caractérise par une réponse hyperinflammatoire et un dysfonctionnement immunitaire subséquent1,2. La septicémie représente une priorité mondiale en matière de santé et cause un nombre élevé de décès dans les unités de soins intensifs (USI)3. L’incidence de la septicémie est estimée à plus de 30 millions de cas dans le monde par an, avec des taux de mortalité aussi élevés que 30% malgré les progrès dans la gestion des soins intensifs4,5. En 2017, l’Organisation mondiale de la Santé a adopté une résolution visant à améliorer la prévention, le diagnostic et la prise en charge de cette maladie mortelle5. Cependant, des études récentes ont montré que la mort ne résulte pas d’une infection primaire chez les patients septiques graves, mais plutôt d’une infection nosocomiale secondaire (en particulier la pneumonie) causée par l’immunosuppression6,7 . Par conséquent, la compréhension des mécanismes de pourquoi les patients septiques développent l’infection secondaire et découvrant des traitements plus efficaces sont urgentes. Ici, un modèle double, également connu sous le nom d’un modèle à double coup, pour étudier le phénomène immunosuppresseur se produisant dans les patients présentant le sepsis prolongé est décrit.

Comme modèle expérimental de référence dans la recherche sur la septicémie polymicrobienne, la ligature et la ponction célérique (CLP) est une chirurgie caractérisée par la ligature et la perforation du cœur, qui contribue à la péritoite polymicrobienne et à la septicémie8,9 . Le processus pathophysiologique et les profils de cytokine, ainsi que la cinétique et l’ampleur, sont semblables à la septicémie clinique. La position de la ligature, la taille de l’aiguille utilisée pour la ponction et le nombre de cils sont des facteurs majeurs qui influent sur la mortalité après le PCL.

La pneumonie nosocomiale est la principale cause de mortalité parmi les patients gravement malades présentant le sepsis. Le principal type d’organismes à l’origine d’une septicémie sévère comprend Staphylococcus aureus (20,5 %), les espèces de Pseudomonas (19,9 %), les entérobactéries (principalement E. coli, 16,0 %) et les champignons (19 %). Pendant ce temps, des études récentes ont suggéré une incidence croissante d’organismes gram-positifs, qui sont maintenant presque aussi fréquents que les infections gram-négatives3.

La méthode décrite dans ce protocole implique CLP, exécuté comme « premier coup » pour induire la péritonisite polymicrobienne sublétale, qui manifeste une condition d’immunosuppression. La procédure implique également l’instillation intranasale ultérieure de S. aureus comme « deuxième coup » pour fournir une plate-forme de recherche médicalement pertinente.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été exécutées conformément au National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux des animaux de l’Université du Dakota du Nord (IACUC). 1. Ligature et perforation de cecal REMARQUE : Les souris femelles C57BL/6 (poids, 18-22 g ; âge, 6-8 semaines) sont aléatoirement divisées en six groupes : groupe témoin (Ctrl), gr…

Representative Results

Selon la conception et les procédures expérimentales, les souris C57BL/6 ont été soumises au CLP, et après 3 jours, elles ont été administrées des bactéries intranasally (figure 1). Comme le montre la figure 2, les souris ont commencé à mourir à 12 h après l’induction de la péritoyte. Deux souris dans le groupe de CLP-SA et trois souris dans le groupe de CLP-NS sont mortes avant l’instillation intranasale de S. …

Discussion

Comme modèle d’étalon-or pour la recherche sur la septicémie, CLP a une combinaison de trois insultes, y compris les traumatismes tissulaires causés par la laparotomie, la nécrose due à la ligature du cècum, et l’infection à la suite de fuites microbiennes qui provoque la péritoyite avec translocation de bactéries dans le sang8. Par conséquent, CLP imite la complexité de la septicémie humaine mieux que beaucoup d’autres modèles. Cependant, une limitation majeure du modèle actuel de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été soutenus par les National Institutes of Health Grants R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01 et AI097532-01A1 à M. W. Les installations de base de l’Université du Dakota du Nord ont été financées par des subventions des NIH (INBRE P20GM103442 et COBRE P20GM113123). Ce travail a également été soutenu par le programme clé de la National Nature Science Foundation of China (81530063) à Jianxin Jiang. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. Nous remercions Marvin Leier (Center for Rural Health, Université du Dakota du Nord) d’avoir fait la vidéo.

Materials

21 G 1 ½ Needle BD BD305167
ACK lysing buffer Gibco A10492-01
Anti-mouse CD11b antibody Biolegend 101201
Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody Biolegend 108401
C57BL/6 mice  Harlan (Indianapolis) C57BL/6NHsd
Desk light General Supply General Supply
Disinfecting wipes Clorox B07NV5JMCS
Electric razor General Supply General Supply
ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) Invitrogen 88-7013, 88-7064, and 88-7324
Iodine Dynarex B003U463PY PVP Iodine Wipes
Ketamine FORT DODGE NDC 0856-2013-01 Amine hydrochloride injection
Laboratory scale General Supply General Supply
LB Agar, Miller Fisher Scientific BP1425-500 Molecular genetics, powder
Micropipette ErgoOne 7100-1100
Normal saline General Supply General Supply
Polylined towel CardinalHealth, Convertors 3520 Surgical drape, sterile, for single use only
Silk suture, 4-0 DAVIS & GECK 1123-31
Small animal needle holder General Supply General Supply
Small animal surgery scissors General Supply General Supply
Small animal surgical forceps General Supply General Supply
Staphylococcus aureus ATCC 13301
Warm pad General Supply General Supply
Xylazine Alfa Aesar 7361-61-7

References

  1. Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
  2. Delano, M. J., Ward, P. A. The immune system’s role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome. Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).
  3. Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. C. Epidemiology of severe sepsis. Virulence. 5 (1), 4-11 (2014).
  4. Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
  5. Reinhart, K., et al. Recognizing Sepsis as a Global Health Priority – A WHO Resolution. The New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).
  6. Boomer, J. S., et al. Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure. JAMA. 306 (23), 2594-2605 (2011).
  7. Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 862-874 (2013).
  8. Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis?. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
  9. Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
  10. Hugunin, K. M. S., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34 (3), 250-260 (2010).
  11. He, S., et al. Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice. PLoS Pathogens. 12 (7), 23 (2016).
  12. Pu, Q. Q., et al. Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis. Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).
  13. Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).
  14. Chin, W., et al. A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset. Nature Communications. 9 (1), 917 (2018).
  15. Nascimento, D. C., et al. IL-33 contributes to sepsis-induced long-term immunosuppression by expanding the regulatory T cell population. Nature Communications. 8, 14919 (2017).
  16. Deng, D., et al. Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics. International Immunopharmacology. 42, 49-58 (2017).

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Cite This Article
Wang, Z., Pu, Q., Lin, P., Li, C., Jiang, J., Wu, M. Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression. J. Vis. Exp. (148), e59386, doi:10.3791/59386 (2019).

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