Summary

Verwendung von Caenorhabditis elegans zur Untersuchung der trans- und mehrgenerationenlichen Wirkungen von Toxischen Stoffen

Published: July 29, 2019
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Summary

Trans- und mehrgenerationenische Wirkungen persistenter Chemikalien sind für die Beurteilung ihrer langfristigen Folgen für die Umwelt und die menschliche Gesundheit von wesentlicher Bedeutung. Wir bieten neuartige detaillierte Methoden zur Untersuchung von Trans- und Mehrgenerationeneffekten mit der freilebenden Nematode Caenorhabditis elegans.

Abstract

Informationen über Toxizitäten von Chemikalien sind für ihre Anwendung und Abfallbewirtschaftung von wesentlicher Bedeutung. Bei Chemikalien in niedrigen Konzentrationen sind die langfristigen Auswirkungen sehr wichtig, um ihre Folgen für die Umwelt und die menschliche Gesundheit zu beurteilen. Bei der Demonstration langfristiger Einflüsse liefern die Auswirkungen von Chemikalien über Generationen hinweg in neueren Studien neue Erkenntnisse. Hier beschreiben wir Protokolle zur Untersuchung der Wirkung von Chemikalien über mehrere Generationen mit frei lebenden Nematoden Caenorhabditis elegans. Zwei Aspekte werden vorgestellt: (1) trans-generationale (TG) und (2) Mehrgenerationeneffektstudien, von denen letztere durch Mehrgenerationenexposition (MGE) und Mehrgenerationen-Resteffektstudien (MGR) getrennt sind. Die TG-Effektstudie ist robust mit einem einfachen Zweck, um festzustellen, ob eine chemische Exposition gegenüber Eltern zu Restfolgen für den Nachwuchs führen kann. Nachdem die Auswirkungen auf die Eltern gemessen wurden, werden Natriumhypochlorit-Lösungen verwendet, um die Eltern zu töten und den Nachwuchs zu halten, um die Wirkungsmessung auf den Nachwuchs zu erleichtern. Die TG-Effektstudie wird verwendet, um festzustellen, ob die Nachkommen betroffen sind, wenn ihr Elternteil den Schadstoffen ausgesetzt ist. Die MGE- und MGR-Effektstudie wird systematisch verwendet, um festzustellen, ob eine kontinuierliche Generationenexposition zu adaptiven Reaktionen bei Nachkommen über Generationen führen kann. Sorgfältige Abholung und Übertragung werden verwendet, um Generationen zu unterscheiden, um die Wirkungsmessung an jeder Generation zu erleichtern. Wir haben auch Protokolle kombiniert, um Das Bewegungsverhalten, die Fortpflanzung, die Lebensdauer, die biochemischen und Genexpressionsänderungen zu messen. Einige Beispielexperimente werden auch vorgestellt, um die trans- und mehrgenerationenischen Effektstudien zu veranschaulichen.

Introduction

Die Anwendung und Abfallbewirtschaftung von Chemikalien hängt in hohem Maße von der Information ihrer Auswirkungen bei bestimmten Konzentrationen ab. Insbesondere ist die Zeit ein weiteres wesentliches Element zwischen Wirkungen und Konzentrationen. Das heißt, Chemikalien, insbesondere solche mit geringen Konzentrationen in den tatsächlichen Umgebungen, brauchen Zeit, um messbare Effekte zu provozieren1. Daher ordnen die Forscher unterschiedliche Längen der Expositionsdauer in Tierversuchen an und decken sogar den gesamten Lebenszyklus ab. Zum Beispiel waren Mäuse für 30, 90 oder 180 Tage Nikotin ausgesetzt, um seine toxischen Wirkungen zu untersuchen 2. Dennoch reichen solche Expositionsdauern immer noch nicht aus, um die langfristigen Auswirkungen von Schadstoffen (z. B. persistente organische Schadstoffe [POP]) aufzuklären, die über Generationen von Organismen in der Umwelt andauern können. Daher gewinnen Studien über Auswirkungen über Generationen immer mehr Aufmerksamkeit.

Es gibt zwei Hauptaspekte in Generationeneffektstudien. Die erste ist die transgenerationale (TG) Effektstudie, die robust testen kann, ob eine chemische Exposition gegenüber Eltern Auswirkungen auf den Nachwuchs haben kann3. Die zweite ist eine Mehrgenerationen-Effektstudie, die systematischer ist und sowohl bei der Exposition als auch bei den Resteffekten berücksichtigt wird. Einerseits werden die Multi-Generationen-Expositionseffekte (MGE) verwendet, um adaptive Reaktionen bei Tieren auf die langfristig herausfordernden Umgebungen zu veranschaulichen. Andererseits werden die Mehrgenerationen-Resteffekte (MGR) verwendet, um die langfristigen Restfolgen nach der Exposition zu demonstrieren, da die mütterliche Exposition mit einer Embryo-Exposition gegenüber den ersten Nachkommen und einer Keimbahn-Exposition gegenüber der zweiten Nachkommen, die den dritten Nachwuchs als erste Generation vollständig aus der Exposition4macht.

Obwohl Säugetiere (z. B. Mäuse) Musterorganismen in Toxizitätsstudien sind, insbesondere in Bezug auf den Menschen, ist ihre Anwendung bei der Untersuchung von Generationenwirkungen recht zeitaufwändig, teuer und ethisch in Bezug auf 5. Dementsprechend bieten Organismen wie die Krebstiere Daphnia magna6, Dasinsekt Drosophila melanogaster7 und der Zebrafisch Danio rerio8alternative Möglichkeiten. Doch diese Organismen haben entweder keine Ähnlichkeiten mit dem Menschen oder benötigen spezifische Ausrüstung in Studien.

Caenorhabditis elegans ist eine kleine freilebende Nematode (ca. 1 mm lang) mit einem kurzen Lebenszyklus (ca. 84 h bei 20 °C)9. Diese Nematode teilt viele biologische Wege konservativ für den Menschen, und daher wurde es weit verbreitet verwendet, um die Auswirkungen von verschiedenen Belastungen oder Giftstoffe zu veranschaulichen10. Insbesondere sind 99,5% der Nematoden Hermaphrodite, die diese Organismen sehr geeignet machen, um Generationeneffekte zu untersuchen, z. B. TG-Effekte von Schwermetallen und Sulfonamiden3,11, MGE-Effekte von Gold-Nanopartikeln und schweren Metalle12 und Temperatur13, MGR-Effekte von Sulfonamid14, und sowohl MGE und MGR-Effekte der Gamma-Bestrahlung15 und Lindan4. Darüber hinaus wurden vergleichbare Ergebnisse zwischen den Wirkungen von Chemikalien (z. B. Zearalenon) auf die Entwicklung und Fortpflanzung von Mäusen und C. elegans16,17gefunden, was einen Vorteil für die Extrapolatung Auswirkungen dieses kleinen Tieres auf den Menschen.

Sowohl TG- als auch MG-Effektstudien sind zeitaufwändig und benötigen sorgfältiges Design und Leistung. Insbesondere bestanden in den oben genannten Studien Unterschiede bei der Wahl des Lebensstadiums, den Expositionsbedingungen und den Methoden der Generationstrennung. Diese Unterschiede behinderten den direkten Vergleich der Ergebnisse und behinderten die weitere Interpretation der Ergebnisse. Daher ist es unerlässlich, einheitliche Protokolle zur Orientierung von TG- und MG-Effektstudien zu erstellen und auch ein größeres Bild zu liefern, um ähnliche Muster verschiedener Giftstoffe oder Schadstoffe in langfristigen Folgen aufzudecken. Das überzielige Ziel der vorliegenden Protokolle wird klare Arbeitsabläufe bei der Untersuchung von Trans- und Mehrgenerationeneffekten mit C. elegansdemonstrieren. Die Protokolle werden Forschern zugute kommen, die daran interessiert sind, die langfristigen Auswirkungen von Giftstoffen oder Schadstoffen zu untersuchen.

Protocol

1. Kultur E. coli OP50 1 M Natriumhydroxidlösung vorbereiten, indem 4 g Natriumhydroxid in 100 ml Wasser gelöst werden. Bereiten Sie Lysogeny-Brühe (LB) Medium durch Auflösen von 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g Natriumchlorid mit 1 L reinem Reinstwasser in einem 1 L konischen Kolben. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit 1 M Natriumhydroxidlösung ein. Aliquot das LB flüssige Medium von Schritt1.2 in 20 konische Kolben (maximal zulässiges Volumen: 100 ml) mit jeweils 50 m…

Representative Results

Hier beschreiben wir Protokolle zur Untersuchung der Wirkung von Chemikalien über Generationen hinweg mit C. elegans in transgenerationalen (TG), Mehrgenerationenexpositionen (MGE) und Mehrgenerationen-Resteffektstudien (MGR). Als Beispiele werden unsere eigenen Forschungsergebnisse vorgestellt. Eine Studie präsentiert die TG-Effekte von Schwermetallen auf das Bewegungsverhalten3. Die beiden anderen Studien zeigen MGE- und MGR-Wirkungen von Sulfomethoxaz…

Discussion

Um das beschriebene Protokoll erfolgreich durchführen zu können, sollten die folgenden Vorschläge berücksichtigt werden. Führen Sie die gesamten experimentellen Operationen in einer sterilen Umgebung durch. Unsachgemäße Bedienung kann zu einer Kontamination der E. coli-Stämme führen, z. B. Pilze und Milben können das normale Wachstum von C. elegans behindern und somit die experimentellen Ergebnisse beeinflussen. Beobachten Sie im Abschnitt, der die Kultivierung von C. elegans beschrei…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

 agar powder OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 9002-18-0
79nnHT Fast Real-Time PCR System  Applied Biosystems 
96-well sterile microplate Costar,Corning,America
Autoclave sterilizer Tomy, Tomy Digital Biology, Japan
Biosafety cabinet LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, China
calcium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10043-52-4
centrifuge  5417R Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Centrifuge tubes Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, America
cholesterol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 57-88-5
Dimethyl sulfoxide VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, America 67-68-5
disodium hydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7558-79-4
ethanol Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 64-17-5
Filter Thermo, Thermo Fisher Scientific, America
incubator YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, China
inoculating loop
K2HPO4•3H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 16788-57-1
kraft paper
Mcroplate Reader Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4•7H2O Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 10034-99-8
Microscopes XTL-BM-9TD BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, China 
Petri dishes
Pipette Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Germany
Potassium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7447-40-7
potassium dihydrogen phosphate Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7778-77-0
Qiagen RNeasy kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
QuantiTect SYBR Green RT-PCR kits Qiagen Inc., Valencia, CA, United States
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Scientific, Wilmington, DE, United States
sodium chloride Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 7647-14-5
sodium hydroxide Sinopharm chemical reagent company Ltd, China 1310-73-2
sodium hypochlorite solution Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co. Ltd, China 7681-52-9
tryptone OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 73049-73-7
yeast extract OXOID, Thermo Fisher Scientific, UK 119-44-8

References

  1. Yu, Z., Zhang, J., Hou, M. The time-dependent stimulation of sodium halide salts on redox reactants, energy supply and luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Hazardous Materials. 342, 429-435 (2018).
  2. Li, W., et al. Long-term nicotine exposure induces dysfunction of mouse endothelial progenitor cells. Experimental and Therapeutic. 13, 85-90 (2017).
  3. Yu, Z. Y., Chen, X. X., Zhang, J., Wang, R., Yin, D. Q. Transgenerational effects of heavy metals on L3 larva of Caenorhabditis elegans with greater behavior and growth inhibitions in the progeny. Ecotoxicology and Environmental Safety. 88C, 178-184 (2013).
  4. Chen, R., Yu, Z., Yin, D. Multi-generational effects of lindane on nematode lipid metabolism with disturbances on insulin-like signal pathway. Chemosphere. 210, 607-614 (2018).
  5. Van Norman, G. A. A matter of mice and men: ethical issues in animal experimentation. International Anesthesiology Clinics. 53 (3), 63-78 (2015).
  6. Pereira, C. M. S., Everaert, G., Blust, R., De Schamphelaere, K. A. C. Multigenerational effects of nickel on Daphnia magna depend on temperature and the magnitude of the effect in the first generation. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (7), 1877-1888 (2018).
  7. Morimoto, J., Simpson, S. J., Ponton, F. Direct and trans-generational effects of male and female gut microbiota in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 13, 20160966 (2017).
  8. Coimbra, A. M., et al. Chronic effects of clofibric acid in zebrafish (Danio rerio): A multigenerational study. Aquatic Toxicology. 160, 76-86 (2015).
  9. Sugi, T. Genome editing in C. elegans and other nematode species. International Journal of Molecular Sciences. 17, 295 (2016).
  10. Leung, M. C. K., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Science. 106 (1), 5-28 (2008).
  11. Yu, Z. Y., Jiang, L., Yin, D. Q. Behavior toxicity to Caenorhabditis elegans transferred to the progeny after exposure to sulfamethoxazole at environmentally relevant concentration. Journal of Environmental Sciences-China. 23 (2), 294-300 (2011).
  12. Kim, S. W., Kwak, J. I., An, Y. J. Multigenerational study of gold nanoparticles in Caenorhabditis elegans: transgenerational effect of maternal exposure. Environmental Science & Technology. 47, 5393-5399 (2013).
  13. Klosin, A., Casas, E., Hidalgo-Carcedo, C., Vavouri, T., Lehner, B. Transgenerational transmission of environmental information in C. elegans. Science. 356, 320 (2017).
  14. Yu, Z. Y., et al. Trans-generational influences of sulfamethoxazole on lifespan, reproduction and population growth of Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and Environmental Safety. 135, 312-318 (2017).
  15. Buisset-Goussen, A., et al. Effects of chronic gamma irradiation: a multigenerational study using Caenorhabditis elegans. Radioactivity. 137, 190-197 (2014).
  16. Zhao, F., et al. Multigenerational exposure to dietary zearalenone (ZEA), anestrogenic mycotoxin, affects puberty and reproductionin female mice. Reproductive Toxicology. 47, 81-88 (2014).
  17. Yang, Z., Wang, J., Tang, L., Sun, X., Xue, K. S. Transgenerational comparison of developmental and reproductive toxicities in zearalenone exposed Caenorhabditis elegans. Asian Journal of Ecotoxicology. 11 (4), 61-68 (2016).
  18. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis dlegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  19. Emmons, S., Klass, M., Hirsch, D. An analysis of the constancy of DNA sequences during development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 1333-1337 (1979).
  20. Van Gilst, M. R., Hadjivassiliou, H., Yamamoto, K. R. A Caenorhabditis elegans nutrient response system partially dependent on nuclear receptor NHR-49. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13496-13501 (2005).
  21. Cobb, E., Hall, J., Palazzolo, D. L. Induction of metallothionein expression after exposure to conventional cigarette smoke but not electronic cigarette (ECIG)-generated aerosol in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Physiology. 9, 426 (2018).
  22. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  23. Hill, R., et al. Genetic flexibility in the convergent evolution of hermaphroditism in Caenorhabditis Nematodes. Developmental Cell. 10, 531-538 (2006).
  24. Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 2013, 1300-1310 (2013).
  25. Breider, F., von Gunten, U. Quantification of total N-nitrosamine concentrations in aqueous samples via UV-photolysis and chemiluminescence detection of nitric oxide. Analytical Chemistry. 89 (3), 1574-1582 (2017).

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Cite This Article
Li, Z., Ai, F., Zhang, J., Yu, Z., Yin, D. Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants. J. Vis. Exp. (149), e59367, doi:10.3791/59367 (2019).

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