Estudando efeitos de radiação tecidual normais usando Hydrogels de matriz extracelular
Summary
Este protocolo apresenta um método para a decelularização e a formação subseqüente do hidrogel de almofadas gordas mamária murino que seguem a irradiação ex vivo.
Abstract
A radiação é uma terapia para pacientes com câncer de mama triplo negativo. O efeito da radiação na matriz extracelular (ECM) do tecido saudável do peito e de seu papel no retorno local no local preliminar do tumor é desconhecido. Aqui nós apresentamos um método para o decellularization, o lyophilization, e a fabricação de hidrogéis do ECM derivados das almofadas gordas mamária murino. Os resultados são apresentados sobre a efetividade do processo de descelularização, e os parâmetros reológicos foram avaliados. As células de câncer de mama com rótulo de GFP e luciferase encapsuladas nos hidrogéis demonstraram um aumento na proliferação de hidrogéis irradiados. Finalmente, a mancha do conjugado do faloidina foi empregada para visualizar a organização do citoesqueleto de pilhas encapsuladas do tumor. Nosso objetivo é apresentar um método para fabricar hidrogéis para estudo in vitro que imitam o ambiente do tecido mamário in vivo e sua resposta à radiação, a fim de estudar o comportamento das células tumorais.
Introduction
O câncer é caracterizado por excesso de proliferação de células que podem evadir a apoptose e também metastasizar para locais distantes1. O câncer de mama é uma das formas mais comuns entre as fêmeas nos EUA, com uma estimativa de 266.000 novos casos e 40.000 mortes em 20182. Um subtipo particularmente agressivo e difícil de tratar é o cancro da mama triplo negativo (TNBC), que carece de receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (RP), e fator de crescimento epidérmico humano (HER2). A radioterapia é comumente usada no câncer de mama para eliminar células tumorais residuais após a lumpectomia, mas mais de 13% dos pacientes com TNBC ainda experimentam recidiva no sítio primário do tumor3.
Sabe-se que a radioterapia é efetiva na mitigação da metástase e recorrência, pois a combinação de lumpectomia e radiação resulta na mesma sobrevida em longo prazo que a mastectomia4. Entretanto, tem-se mostrado recentemente que o tratamento de radiação é associado com o retorno local ao local preliminar do tumor em ajustes imunocomprometidos5,6. Além disso, é bem sabido que a radiação modifica a matriz extracelular (ECM) do tecido normal induzindo fibrose7. Conseqüentemente, é importante compreender o papel de mudanças radiação-induzidas do ECM em diating o comportamento da pilha do tumor.
Os tecidos decelularizados têm sido utilizados como modelos in vitro para o estudo da doença8,9. Estes tecidos decelularizados preservam a composição do ECM e recapitulam o complexo ECM in vivo. Este ECM descelularizados do tecido pode mais ser processado e digerido para dar forma a hidrogéis reconstituídos do ECM que podem ser usados para estudar o crescimento da pilha e a função10,11. Por exemplo, os hidrogéis injetáveis derivados do lipoaspirado humano decelularizado e do tecido miocárdico serviram como métodos não invasivos de engenharia tecidual, e um hidrogel derivado do tecido pulmonar porcino foi utilizado como método in vitro de teste fixação e viabilidade de células-tronco mesenquimais12,13,14. O efeito de dano normal da radiação do tecido em Propriedades do ECM, entretanto, não foi investigado.
Os hidrogéis derivados do ECM têm o maior potencial para o estudo in vitro de fenômenos in vivo. Vários outros materiais foram estudados, incluindo colágeno, fibrina e matrigel, mas é difícil recapitular sinteticamente a composição do ECM13. Uma vantagem do uso de hidrogéis derivados de ECM é que o ECM contém as proteínas e fatores de crescimento necessários para um determinado tecido14,15. A irradiação do tecido normal durante lumpectomy causa mudanças significativas ao ECM, e os hidrogéis ECM-derivados podem ser usados para estudar este efeito in vitro. Este método poderia conduzir a uns modelos in vitro mais complexos e mais exatos da doença.
Neste estudo, nós sujeitamos almofadas gordas mamária murino (MFPs) à radiação ex vivo. Os MFPs foram descelularizados e feito na solução do pre-gel. Os hydrogels foram dados forma com as pilhas 4T1 encaixadas, uma linha celular murino de TNBC. As propriedades reológicas do material do hidrogel foram examinadas, e a dinâmica da pilha do tumor foi avaliada dentro dos hydrogels. Hidrogéis fabricados a partir de MFPs irradiados reforçada proliferação de células tumorais. Os estudos futuros incorporarão outros tipos da pilha para estudar interações da pilha-pilha no contexto do retorno do cancro depois da terapia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método de formação de hidrogel é em grande parte dependente da quantidade de tecido inicial. Os MFPs murinos são pequenos, e o processo de descelularização resulta em uma redução significativa do material (tabela 1). O processo pode ser repetido com mais MFPs para aumentar o rendimento final. O fresamento é outro passo importante que pode levar à perda de material. Outros mostraram sucesso com um moinho criogênico, mas este protocolo é baseado na moagem através de uma argamassa de mão…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Dr. Laura L. Bronsart por fornecer as células GFP-e luciferase-4T1, Dr. Edward l. lagory para o Conselho em 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo)-2-naphthol que mancha, Dr. Craig L. Duvall para ivis e uso do Liofilizador, e Dr. Scott A. guelcher para o Reômetro Usar. Esta pesquisa foi apoiada financeiramente pela concessão de NIH #R00CA201304.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | – |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | – |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | – |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | – |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | – |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | – |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | – |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | – |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | – |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | – |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | – |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | – |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | – |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | – |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | – |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | – |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | – |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | – |
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