A estabilidade térmica da atividade da enzima é facilmente medida por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A maioria dos ensaios de estabilidade da proteína atualmente usado medida desdobramento de proteínas, mas não fornecem informações sobre a atividade enzimática. ITC permite a determinação direta do efeito das modificações da enzima na estabilidade da atividade enzimática.
Este trabalho demonstra um novo método para medir a estabilidade da actividade enzimática por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A taxa de calor máxima observada após uma única injeção da solução de substrato em uma solução de enzima está correlacionada com a atividade da enzima. Múltiplas injeções do substrato para a mesma solução de enzima ao longo do tempo mostram a perda da atividade enzimática. O ensaio é autónomo, exigindo pouco tempo pessoal e é aplicável à maioria dos meios de comunicação e enzimas.
As enzimas são proteínas capazes de catalisar uma ampla gama de reações orgânicas. Função da maioria das enzimas em solução aquosa a perto de pH neutro, evitando assim o uso de solventes ásperos. Por causa de sua alta seletividade, reacções enzimáticas catalisadas produzem menos (em alguns casos, sem subprodutos) subprodutos do que não-seletivo catalizadores tais como ácidos e bases1. Isto é especialmente relevante na fabricação de alimentos onde todas as reações químicas devem ser feitas para que o produto final é seguro para consumo humano. Atualmente, as enzimas são usadas para produzir alta frutose xarope de milho2, queijo3, cerveja4, leite sem lactose5e outros produtos alimentares importantes. Enquanto este artigo centra-se na utilização de enzimas na indústria de alimentos, existem muitos outros usos para enzimas, incluindo na síntese química e droga verde.
O utilitário de enzimas é limitado pela estabilidade da atividade enzimática, que depende de manter a estrutura tridimensional da enzima. A estrutura da enzima pode ser estabilizada por modificações como PEGylation6, imobilização em um suporte sólido7, as modificações genéticas8e formulações. Atualmente, a estabilidade da enzima é normalmente medida por Calorimetria exploratória diferencial (DSC) e9ensaios de atividade enzimática de ponto de extremidade. DSC mede a temperatura na qual uma enzima se desenrola; Quanto maior a temperatura, mais estável a estrutura. No entanto, a perda de atividade ocorre frequentemente em uma temperatura mais baixa do que o necessário para desdobrar a enzima ou domínios dentro do enzima10. Portanto, DSC não é suficiente para determinar se uma modificação da enzima aumenta a estabilidade da atividade enzimática. Ensaios enzimáticos de ponto de extremidade são geralmente tempo intensivo, requerem amostras múltiplas e muitas vezes envolvem uma reação colorimétrica acoplada que não é aplicável para soluções altamente coloridas ou opacas ou suspensões.
Este trabalho demonstra um método para a medição direta da estabilidade da atividade enzimática por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). ITC mede a taxa de calor liberado ou absorvido durante o curso de uma reação. Desde que quase todas as reações produzem ou absorvem calor, ITC pode ser usado para a maioria das reações catalisada por enzimas, incluindo reações que não têm uma reação de acoplamento ou ocorrem em meios opacos, como leite. ITC tem sido usado por muitas décadas para medir parâmetros de cinéticos químicos para muitos tipos de reações, mas o protocolo apresentado aqui se concentra no uso ITC para medir a taxa de pico de calor de reações catalisadas por enzimas e demonstra que a atividade da enzima é linearmente correlacionada com a taxa de pico de calor. ITC medições de taxas de pico de calor na maior parte são autônomas e exigem muito pouco tempo pessoal para configurar e analisar.
Uma grande vantagem do ensaio de estabilidade de enzima do ITC descrito aqui é automação. Uma vez que todos os buffers de adequadas e soluções são feitas, o tempo de set-up para cada ensaio é aproximadamente 15 min. para a pessoa que faz o ensaio. Em contraste, os ensaios convencionais para atividade de invertase e lactase requerem cerca de 2 h com envolvimento contínuo da pessoa fazendo o ensaio e muitos ensaios de atividade enzimática levar consideravelmente mais de homens-hora. Em uma publicação anterior, d…
The authors have nothing to disclose.
Nenhum
a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |