近赤外蛍光剤や生物学的プローブに組み込まれて染料からの画像データを利用した、ラットの尾静脈注射を検証する方法をご紹介します。尾の前にイメージを作成し、蛍光シグナルの定量化、注入後、注射の品質の評価をしました。
ラットの尾静脈に薬剤の静脈内投与 (IV) の投与は困難と矛盾することができます。尾静脈注射を最適化すると、試薬が血流中に直接導入する必要がある、多くの実験プロシージャの重要な部分です。無意識のうちに、注射は皮下、おそらく科学的な成果を変更することができます。法人の近赤外蛍光 (NIRF) 色素をナノエマルション ベースの生物学的プローブを利用して、このメソッドはイメージングに成功した尾静脈注射体内.の機能を提供していますNIRF 撮像素子を使って、エージェントの注入の前後に画像を撮影します。許容の静脈注射は、質的または量的に基づいて決定されます注射部位における NIRF 信号の強度。
小動物に薬剤の投与経路は、多くの実験の重要なポイントとして機能します。エージェントが配信され、その後、エージェントにその後どうなるかを決定します。エージェント管理1のため、他のルートを使用できますが、配信の静脈内のルートは特定のエージェントの優先ルートです。IV 注入では、エージェントが組織初回通過効果と無関係な溶質の absorption1 の必要性のバイパス、血流に直接注入することができます。これは、ターゲット細胞の血流2,3循環システム内のすべての組織への直接配信。齧歯類で、頸、伏在、尾静脈など、いくつかの静脈を考えることが。
このメソッドで、NIRF は、生物学的プローブを含む染料-この場合、ナノエマルション (図 1 a)3,4,5,6-ラットの外側尾静脈に注入されます。この特定の NIRF を含むナノエマルションを以前画像し、体内と神経因性疼痛2,3,4、ラット モデル9 vivo7, 8 ex neuroinflammation を追跡に使用されています 5,10,11。前に、と前臨床の近赤外蛍光イメージャの注射後にイメージングを実施 (材料の表を参照してください)。これは、エージェントの管理の品質を検証するためのツールとして提供しています。基準画像を得るための基礎として尾静脈注射で前にイメージングします。
ますます動物実験で投与ナノエマル ジョンが生物学的プローブおよびターゲット エージェント12,13,14,15として使用されています。それは尾静脈16,17を介してエージェントを管理する実績のある挑戦-薬、ウイルスのベクトルまたは別のプローブ-注入の内容全体が血流を正常に入力したことを確認するではなく、周囲組織17。したがって、視覚化および成功した注入の品質評価法は有益です。
通常、熱ランプまたは暖かい水は注入前にその可視化を許可、静脈の拡張を引き起こす尾を暖めるために使用されます。これにより静脈への参入容易、化合物がその全体18,19,20,21に血流を入力したかどうかを識別する定量的な方法はないです。これは、静脈とは対照的かすかに皮膚など黒いマウスで動物の系統でまだより困難になります。通常、調査官は抵抗噴射時と、エージェント22,23の皮下漏出を示す尻尾の膨らみを可視化するいくつかのケースを体験することで失敗した注入を測ることができます。
小動物 NIRF イメージング システムに本研究で生きているラットの外側尾静脈に注射したナノエマルションの NIRF イメージングの実行 (材料の表を参照してください)。ラットが、特別な精製 (材料の表を参照) をダイエット腸の非特異蛍光を抑える。白い光と 800 nm の蛍光の同時画像集録は、NIRF 撮像素子と関連ソフトウェアを使用してキャプチャされます。プレ噴射やポスト噴射状態で尻尾に相対的な蛍光強度を測定します。注入のサイトで利益 (率 ROI) の領域の蛍光強度を記録および投資収益率の面積で割った値します。注射が許容される定性的な評価が可能です。さらに必要に応じて、許容可能な注射のためのしきい値を設定し、その時点で統計的有意性を計算することができますグループに投資収益率の測定を割り当てることによっては定量分析を実行できます。
尾静脈注射の後この検証戦略を活用することにより研究の標準がエージェント管理の整合性の向上により向上します。尾静脈注射の品質を評価するためのこのメソッドは、いくつかの企業によって商業的に提供される赤外線蛍光プローブを含むように異なる注射剤の簡単にカスタマイズできます。
研究所には、テスト エージェントの失政の結果として大幅なコストがかかります。尾静脈注射は、最もしばしば失政のエラーを負う技術者の経験との一貫した成功率を達成するためにマスターに難しい手法です。成功した注入を確認する確実な方法はありません。このプロトコルは、研究者のマウス尾静脈注射の成功を検証する質的および量的な方法を与えることによってこの問題を解決を提供しています。NIRF ラベル ナノエマルション7,8,25に (薬) この場合は、選択のエージェントが組み込まれていますここでは、NIRF 小動物イメージャの注入のサイトでイメージを作成するとします。また、非ナノエマルション ベース エージェントを開発し、市販の赤外線染料を組み込むことにより NIRF イメージングのと同じ原理を使用するオプションです。さらに、腫瘍イメージング、代謝などのアプリケーションの様々 な準備ができて使用するイメージング エージェントの人身売買、イメージング、細胞し、アポトーシスも市販されています。滅菌針あるいは IV カテーテルでは; を使用して、インジェクションを行うこれは研究者の好みに依存します。さらに、自動化された尾静脈注射26はこのプロセスを支援する使用されている、この方法論と互換性が。しかし、この技術はまだならない市販。
正しいエージェント管理のより高い率を確保する尾静脈注入法の重要なステップがあります。尾はまず、汚れや破片、静脈を視覚化より研究者を許可するを削除するエタノールで洗浄してください。暖かい水でテールを水没によって静脈を拡張はまた方法では、非常に重要なステップ注入の表面積。複数回の試行が必要な場合に、いくつかのエラーより遠位の時点で尾静脈注射します。注射は、動物の体内の尾の側面に近づくと、サイズは尾静脈が大きくなりますと尾のより近位の位置で試みられるべき。さらに、同側の尾静脈よりも 3 〜 5 サイトで針の配置が失敗した場合、対側の尾静脈を使用できます。
テスト エージェントの成功した管理の注射の時点で信号がない NIRF はほとんどの結果します。注入の管理中に抵抗を感じなかったし、尾のない蛍光する少しがある、成功、射出を記録できます。注入時に抵抗が感じられるある場合、テールのいくつかの長さに沿って歩道の NIRF 信号注入は失敗として記録され、可能性が高いし、部分的に皮下。蛍光画像撮影前と後の注入と噴射の質が定性的観察したり、注射部位での蛍光信号の定量的分析による評価。近赤外蛍光イメージャに付属するソフトウェアはこの分析を実行することがしばしばです。
メソッドは、複数の方法で合わせることができます。マウスおよびラットの静脈注射を尻尾に適用されます。ほとんど小動物近赤外蛍光イメージャーはマウスの齧歯動物を収容できます。麻酔のレベルは研究所の IACUC プロトコルに従い、動物の体重に応じて調整する必要があります。研究員の作り出されたエージェントに赤外光吸収色素を組み込むことによって、または特定の生物学的応用に合わせて使えるにイメージング エージェントを購入することによって、別の可能な変更はナノエマルション ベース以外のプローブの準備です。
ネズミが比較的大きい場合に小動物の固体撮像素子の配置が難しいことがあります。テスト画像は、注入前に引き出しの中に動物で撮影、視野確認尾は表示をこのようにお勧めします。画像の中にそれを確保するため、撮像素子の引き出しに尻尾が動かないテープに便利です。
小動物に注射が実験プロシージャを同時に干渉していない動物これらの安楽死が必要な試薬のラベルの利用に限られている尾静脈の品質を評価する方法12,13。いくつかの試薬は、実験的なデザインでのケアをお勧めしますので研究成果と、動物の治療評価影響があります。
このメソッドは、将来的に、小動物イメージング技術として赤外線蛍光プローブの改善で進歩と洗練されたあります。この方法2,3 に記載されている別注射の品質を検証する研究デザインのエージェント管理段階で法人の赤外光吸収色素は、様々 な異なるアプリケーション用に設計された生物学的プローブを使用できます。 ,27,28,29,30,31,32。
The authors have nothing to disclose.
J.A.P. と J.M.J. は、神経因性疼痛に対する効果のため慢性的な狭窄損傷ラットモデルにおけるナノエマル ジョンを評価するための実験的アプローチを共同でデザインしました。J.M.J.、ナノエマル ジョン、ナノエマルションの組成、微細加工技術と全体的なマクロファージ標的薬配信方法に設計されています。J.M.J. は、J.M.J. の指導の下でさらに l. l. によって作製したナノエマルションを生産J.M.J. や s. p. 動物のケア、手術、行動、尾静脈注射によって、ナノエマルションの安定性が評価された、NIRF イメージングを行った共同修士号およびつ J.A.P. の指導の下で原稿が書かれ、理学修士、作製し、プロトコルは、つによって書かれました。
近赤外光イメージングは、デュケイン大学 (ピッツバーグ組織工学イニシアティブ シード補助金サポート) で小動物イメージング システムで実行されました。J.M.J. は、国防総省受賞番号 FA8650-17-2-6836、NIDA 受賞番号 1R21DA039621-01、NIBIB 受賞番号 R21EB023104 02、AFMSA 賞を受賞番号 FA8650-17-2-6836 からサポートを認めています。J.A.P. と J.M.J は、ピッツバーグ組織工学イニシアティブ種子グラントからのサポートを認めます。J.A.P. は、連邦のユニバーサル研究強化賞」とチャールズ ・ ヘンリー ・ リーチ II 基金、エマ冬財団、サミュエル ・ Hunkele 恐ろしい病賞にも認めています。J.A.P. および J.M.J. は、デュケイン大学就任学長の学際的研究コンソーシアム ・ グラント、慢性の痛み研究コンソーシアムを支えるサポートを認めます。
100% Oxygen air tank | AirGas Heathcare | n/a | For ventilation of animal. |
70% Ethanol | Multiple sources | n/a | |
Alcohol Pads | Henry Schein | 112-6131 | |
Artificial Tears | Henry Schein | 100-2634 | This protects the rats eyes while it is anesthetized. |
Beaker | Multiple sources | n/a | This holds warm water to dilate the tail veins. |
Distilled water | Multiple sources | n/a | |
Exhaust Fans | Hazard Technologies | n/a | For ventilation of lab, if it is not built in. |
Face Mask | Multiple sources | n/a | |
Gas Chamber with tubing and face mask | Multiple sources | n/a | |
Gauze Pads | Henry Schein | 100-2634 | |
Hair Bonnet | Multiple sources | n/a | |
Heating Lamp | Multiple sources | n/a | |
Heating Pad | Multiple sources | n/a | |
Isoflurane | Southmedic Inc. | ND66794-013-25 | |
Padded Bench Cloth | Box Board Products Inc. | 026755100I | |
Pearl Small Animal Imager | Li-COR Biosciences | ||
Pearl Trilogy Small Animal Imaging System | LI-COR Biosciences | n/a | Quote available via manufacturers web site. Other manufacturers such as Perkin Elmer (VisEn Medical FMT) offer preclinical NIR fluoresence imagers. |
Scrubs, lab coat, shoe covers | Multiple sources | n/a | |
Sharps container | Multiple sources | n/a | |
special diet | Research Diets, Inc, New Brunswick, NJ | ||
Sprague-Dawley rats | Hilltop Animals, Springdale, PA | ||
Sterile injection cap | Multiple sources | n/a | |
Sterile needle, 27G | Multiple sources | n/a | |
SURFLO IV Catheter, 24G, yellow | TERUMO | SR+OX2419C1 | This is an alternative to using a sterile needle. It provides additional indication of correct venous insertion. |
Surgical gloves | Multiple sources | n/a | |
Surgical Tape | Multiple sources | n/a |