Индукция и характеристика легочной гипертензии у мышей с использованием модели Hypoxia/SU5416
Summary
Этот протокол описывает индукцию легочной гипертензии (PH) у мышей на основе воздействия гипоксии и инъекции антагониста рецепторов VEGF. У животных развивается гипертрофия PH и правого желудочка (Р.В.) через 3 недели после начала протокола. Представлена также функциональная и морфометрическая характеристика модели.
Abstract
Легочная гипертензия (ПХ) является патофизиологическим состоянием, определяемым средним артериальным давлением легких, превышающим 25 мм рт. ст. в состоянии покоя, по оценке катетеризации правого сердца. Широкий спектр заболеваний может привести к PH, отличающийся в своей этиологии, гистопатиологии, клинической презентации, прогноз, и ответ на лечение. Несмотря на значительный прогресс в последние годы, PH остается непросамых заболеваний. Понимание основных механизмов может проложить путь для разработки новых методов лечения. Модели животных являются важными инструментами исследования для достижения этой цели. В настоящее время существует несколько моделей, доступных для повторного воспроизведения PH. В этом протоколе описывается двухухитовая модель PH мыши. Стимулами для развития PH являются гипоксия и инъекция SU5416, сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) антагонист рецепторов. Через три недели после начала Hypoxia/SU5416, животные развивают легочную сосудистую ремоделирование, имитирующее гистопатологические изменения, наблюдаемые в PH человека (преимущественно Группа 1). Сосудистая ремоделирование в легочной циркуляции приводит к реконструкции правого желудочка (Р.В.). Подробно описаны процедуры измерения давления Р.В. (с использованием метода открытой грудной клетки), морфометрический анализ Р.В. (путем вскрытия и взвешивания обоих желудочков сердца) и гистологические оценки ремоделирования (как легочной путем оценки сосудистой ремоделирования, так и сердечной путем оценки гипертрофии и фиброза кардиомиоцитов). Преимуществами этого протокола являются возможность применения как в диком типе, так и у генетически модифицированных мышей, относительно легкая и низкая стоимость реализации, а также быстрое развитие болезни интереса (3 недели). Ограничения этого метода в том, что мыши не развиваются тяжелые фенотип и PH обратима по возвращении к нормоксии. Профилактика, а также исследования терапии, могут быть легко реализованы в этой модели, без необходимости передовых навыков (в отличие от хирургических моделей грызунов).
Introduction
Легочная гипертензия (PH) является патофизиологическим состоянием, определяемым средним давлением легочной артерии (ПА), превышающим 25 мм рт. ст. в состоянии покоя, по оценке катетеризацииправого сердца 1,2. Существует целый ряд заболеваний, которые могут привести к PH. В попытке организовать условия, связанные с PH, было разработано несколько классификационных систем. Текущая клиническая классификация классифицирует множественные заболевания, связанные с PH, в 5 различныхгруппах 1. Это различие имеет важное значение, поскольку различные группы пациентов имеют заболевания, которые отличаются в их клинической презентации, патологии, прогноз, и ответ налечение 2. В таблице 1 кратко излагается нынешняя классификация, дополненная основными гистопатологическими характеристиками каждого заболевания.
Таблица 1: Обзор клинической классификации PH, наряду с основными гистопатологическими особенностями в группах. Пригодность протокола Hypoxia/SU5416 для моделирования PH. Эта таблица была изменена с19. PH: Легочная гипертензия, ПАГ: Легочная артериальная гипертензия
Несмотря на значительные достижения в лечении заболеваний, связанных с PH, PH по-прежнему остается без лечения, с 3-летним коэффициентом смертности в диапазоне от 20% до 80%3. Это указывает на настоятельную необходимость понимания основных механизмов PH и, после этого, развитие новых методов лечения для предотвращения, замедления прогрессирования и лечения болезни. Модели животных имеют решающее значение для этого масштаба. В настоящее время существуют различные модели для изучения PH. Заинтересованный читатель относится к отличным отзывам на эту тему2,,3,,4. Принимая во внимание разнообразие заболеваний, ведущих к PH, очевидно, что различные условия человека PH не могут быть полностью резюмированы в одной модели животных. Доступные модели животных можно классифицировать в i) одноразовых, ii) двух-хит, iii) нокаутом, и iv) модели переэкспрессии3. В одноразовых моделях PH индуцируется одним патологическим стимулом, в то время как двухуголютные модели сочетают в себе два патологических стимула с целью индуцирования более тяжелого PH и, таким образом, более тесно имитируют сложные заболевания человека. Помимо этиологических различий, несколько стимулов приводят к различиям в моделировании PH, которые зависят также от вида и генетического фона животных4.
Один из наиболее часто используемых классических моделей PH грызунов является хроническая гипоксиямодель 2. Гипоксия, как известно, вызывают PH у людей, а также в нескольких видах животных. Гипоксия имеет то преимущество, что физиологический стимул для PH (Таблица 1). Однако, в то время как степень гипоксии, используемой для индуцирования PH у грызунов является гораздо более серьезным, чем у людей, одно оскорбление (гипоксия) приводит только к легкой форме сосудистой ремоделирования. Это не имитирует тяжесть болезни человека. Добавление второго удара, дополнительный стимул для индуцирования PH, показал многообещающие результаты: инъекция соединения SU5416 грызунов в сочетании с гипоксическим стимулом вызывает более тяжелые ФЕНОтип2,5,6. SU5416 является ингибитором сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) рецептора-2. Он блокирует рецепторы VEGF и приводит к эндотелиальной апоптоз клеток. В гипоксических условиях это стимулирует распространение подмножества апоптоз-устойчивых эндотелиальных клеток. Кроме того, SU5416 приводит к гладкой пролиферации мышечных клеток. Сочетание этих эффектов приводит к патологическое сосудистое ремоделирование легочной циркуляции и приводит к повышенному давлению ПА и правого желудочкаремоделирования 2,5,7. Модель была сначала описана у крыс6, а затем применена кмышам 4,,5,,7. Модель мыши демонстрирует менее тяжелую сосудистую ремоделирование по сравнению с крысами. Кроме того, когда возвращается к нормоксия, PH продолжает прогрессировать у крыс, в то время как у мышей это частично обратимым.
В следующем протоколе описаны все шаги по моделированию PH у мышей с использованием метода Hypoxia/SU5416 (планирование, хронология, исполнение). Кроме того, характеристика модели описана в этом протоколе: функционально (путем инвазивного измерения давления правого желудочка (РВ) с использованием открытой техники грудной клетки), морфометрически (путем вскрытия и взвешивания как правого, так и левого желудочков), а также гистологически (путем оценки ремоделирования легочной сосудистой системы, гипертрофии правого желудочка и фиброза).
Все шаги и методы, описанные в этом протоколе, могут быть легко реализованы следователями на любом уровне опыта. Хотя функциональные измерения Р.В. с использованием открытой техники груди (описанный здесь) не является золотым стандартом метода в этой области, он имеет то преимущество, что он может быть быстро изучены и точно воспроизведены даже менее опытный экспериментатор.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает, как моделировать PH у мышей, сочетая два патологических стимула: хроническая гипоксия и инъекция SU5416 (Hypoxia/SU5416)18. В попытке соотнести эту модель мыши с состоянием PH человека, неизбежно следует взглянуть на текущую классификацию PH, показанную в та?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Американской ассоциации сердца (AHA- 17SDG33370112 и 18IPA34170258) и от Национальных институтов здравоохранения NIH K01 HL135474 Y.S. O.B была поддержана Deutsche Herzstiftung.
Materials
| Acetic acid glacial | Roth | 3738.1 | |
| Acetone, Histology Grade | The Lab Depot | VT110D | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Bouin's solution | Sigma | Ht10132 | |
| Cautery System | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Connection tubing and valves | |||
| Cotton-Tipped Applicators | Covidien | 8884541300 | |
| Coverslips, 24 x50 mm | Roth | 1871 | |
| Data Acquisition and Analysis | Emka | iox2 | |
| Direct Red 80 | Sigma | 365548-5G | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Dry ice | |||
| Dumont # 5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont # 7 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Embedding molds | Sigma Aldrich | E-6032 | |
| Eosin Solution Aqueous | Sigma | HT110216 | |
| Ethanol, laboratory Grade | Carolina Biological Supply Company | 861285 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Goat Serum | invitrogen | 16210-064 | |
| Heating pad | Gaymar | T/Pump | |
| Hematoxylin 2 | Thermo Scientific | 7231 | |
| Hypoxic chamber | Biospherix | A30274P | |
| Induction chamber | DRE Veterinary | 12570 | |
| Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") ) | Terumo | SR*FF2025 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-40 | |
| Isoflurane vaporizer | DRE Veterinary | 12432 | |
| Mice (C57BL/6) | Charles River | ||
| Needles 25 G x 5/8" | BD | 305122 | |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Corning | 21-031-CV | |
| Piric Acid- Saturated Solution 1.3 % | Sigma | P6744-1GA | |
| Pressure volume catheter | Transonic | FTH-1212B-4018 | |
| Retractor | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Static oxygen Controller ProOx 360 | Biospherix | P360 | |
| SU 5416 | Sigma Aldrich | S8442 | |
| Surgical Suture, black braided silk, 5.0 | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Syringe 10 ml | BD | 303134 | |
| Syringes with needle 1 ml | BD | 309626 | |
| Sytox Green Nuclein Acid Stain | Thermo Scientific | S7020 | |
| Tenotomy scissors | Pricon | 60-521 | |
| Toluol | Roth | 9558.3 | |
| Ventilator | CWE | SAR-830/P | |
| WGA Alexa Fluor | Thermo Scientific | W11261 | |
| Xylene | Roth |
References
- Galie, N., et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT). European Heart Journal. 37 (1), 67-119 (2016).
- Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 297 (6), 1013-1032 (2009).
- Maarman, G., Lecour, S., Butrous, G., Thienemann, F., Sliwa, K. A comprehensive review: the evolution of animal models in pulmonary hypertension research; are we there yet. Pulmonary Circulation. 3 (4), 739-756 (2013).
- Gomez-Arroyo, J., et al. A brief overview of mouse models of pulmonary arterial hypertension: problems and prospects. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 302 (10), 977-991 (2012).
- Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
- Taraseviciene-Stewart, L., et al. Inhibition of the VEGF receptor 2 combined with chronic hypoxia causes cell death-dependent pulmonary endothelial cell proliferation and severe pulmonary hypertension. FASEB Journal. 15 (2), 427-438 (2001).
- Vitali, S. H., et al. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary hypertension revisited: long-term follow-up. Pulmonary Circulation. 4 (4), 619-629 (2014).
- Breen, E. C., Scadeng, M., Lai, N. C., Murray, F., Bigby, T. D. Functional magnetic resonance imaging for in vivo quantification of pulmonary hypertension in the Sugen 5416/hypoxia mouse. Experimental Physiology. 102 (3), 347-353 (2017).
- Wang, Z., Schreier, D. A., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Progressive right ventricular functional and structural changes in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Physiological Reports. 1 (7), 00184 (2013).
- Momcilovic, M., et al. Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer. Journal of Visualized Experiment. (137), 57167 (2018).
- Guma, S. R., et al. Natural killer cell therapy and aerosol interleukin-2 for the treatment of osteosarcoma lung metastasis. Pediatric Blood Cancer. 61 (4), 618-626 (2014).
- Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
- Penumatsa, K. C., et al. Transglutaminase 2 in pulmonary and cardiac tissue remodeling in experimental pulmonary hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 313 (5), 752-762 (2017).
- Wang, Z., et al. Organ-level right ventricular dysfunction with preserved Frank-Starling mechanism in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Applied Physiology. 124 (5), 1244-1253 (2018).
- van de Veerdonk, M. C., Bogaard, H. J., Voelkel, N. F. The right ventricle and pulmonary hypertension. Heart Failure Reviews. 21 (3), 259-271 (2016).
- Emde, B., Heinen, A., Godecke, A., Bottermann, K. Wheat germ agglutinin staining as a suitable method for detection and quantification of fibrosis in cardiac tissue after myocardial infarction. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2448 (2014).
- Pena, S. D., Gordon, B. B., Karpati, G., Carpenter, S. Lectin histochemistry of human skeletal muscle. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 542-546 (1981).
- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia Mouse Model of Pulmonary Arterial Hypertension. Methods in Molecular Biology. 1816, 243-252 (2018).
- Colvin, K. L., Yeager, M. E. Animal Models of Pulmonary Hypertension: Matching Disease Mechanisms to Etiology of the Human Disease. Journal of Pulmonary and Respiratory Medicine. 4 (4), (2014).
- Benza, R. L., et al. Predicting survival in pulmonary arterial hypertension: insights from the Registry to Evaluate Early and Long-Term Pulmonary Arterial Hypertension Disease Management (REVEAL). Circulation. 122 (2), 164-172 (2010).
- Jacob, S. W., Rosenbaum, E. E. The toxicology of dimethyl sulfoxide (DMSO). Headache. 6 (3), 127-136 (1966).
- Jacob, S. W., Wood, D. C. Dimethyl sulfoxide (DMSO). Toxicology, pharmacology, and clinical experience. American Journal of Surgery. 114 (3), 414-426 (1967).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiment. (103), 52942 (2015).
- Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension. Journal of Visualized Experiment. (110), 53335 (2016).
- Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiment. (111), 53810 (2016).
- Penumatsa, K. C., Warburton, R. R., Hill, N. S., Fanburg, B. L. CrossTalk proposal: The mouse SuHx model is a good model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Physiology. 597 (4), 975-977 (2019).
