Qui presentiamo un protocollo per Ca2 + imaging in neuroni e cellule gliali, che consente la dissezione di Ca2 + segnali a risoluzione subcellulare. Questo processo è applicabile a tutti i tipi di cellulari che permettono l’espressione di codificato geneticamente indicatori di Ca2 + .
Ione calcio (Ca2 +) è una molecola universale messaggero intracellulare che spinge le vie multiple di segnalazione, che conduce alle uscite biologici diversi. Il coordinamento delle sorgenti di segnale due Ca2 + — “Ca2 + afflusso” all’esterno della cellula e memorizzare “Rilascio2 + Ca” da Ca2 + intracellulare del reticolo endoplasmatico (ER) — è considerato per essere alla base i diversi modelli spazio-temporali di Ca 2 + segnali che causano funzioni biologiche nelle cellule. Lo scopo del presente protocollo è di descrivere un nuovo Ca2 + metodo di imaging che consente il monitoraggio del momento di “Afflusso di Ca2 +” e “Ca2 + release”. OER-GCaMP6f è un codificato geneticamente Ca2 + indicatore (GECI) composto da GCaMP6f, che si rivolge alla membrana esterna ER. OER-GCaMP6f può monitorare il rilascio di Ca2 + a una risoluzione temporale superiore convenzionale GCaMP6f. Combinato con membrana plasmatica targeting GECIs, lo spazio-temporali modello Ca2 + segnale può essere descritto in una risoluzione subcellulare. I targeting subcellulare Ca2 + indicatori descritti qui sono, in linea di principio, disponibile per tutti i tipi di cellulari, anche per in vivo imaging dei neuroni di Caenorhabditis elegans . In questo protocollo, introduciamo il Ca2 + imaging in cellule da linee cellulari, neuroni e cellule gliali in colture primarie dissociate e descrivere la preparazione di azione congelate dei neuroni corticali del ratto.
CA2 + segnali rappresentano l’elevazione della concentrazione intracellulare di Ca2 + . CA2 + è il secondo messaggero universale per le cellule eucariotiche. Utilizzo di Ca2 +, cellule funzionano tramite diverse vie di segnalazione intracellulare e inducono varie uscite biologici. Ad esempio, in neuroni, rilascio delle vescicole sinaptiche al terminale presinaptico, espressione genica nel nucleo e induzione di plasticità sinaptica presso la postsynapse sono regolati da distinti segnali di Ca2 + che precisamente attivano l’appropriato enzimi a valle in siti adatti e con una tempistica precisa1.
Modelli specifici spatiotemporal di Ca2 + segnali attivano gli enzimi specifici a valle. CA2 + segnali vengono generati dal coordinamento tra le due diverse Ca2 + fonti: afflusso di Ca2 + dallo spazio extracellulare e il rilascio di Ca2 + dal reticolo endoplasmico (ER), che serve come una Ca intracellulare2 + negozio. Il spatiotemporal Ca2 + segnalazione modello significativo per indurre una funzione specifica delle cellule è supportato anche da nanodomini di 10 – 100 µM Ca2 + generato in prossimità di canali del Ca2 + sulla membrana plasmatica o ER membrana2. D’importanza, la fonte di Ca2 + segnali è uno dei fattori più critici che determinano l’uscita biologico a valle. Nei neuroni, afflusso di Ca2 + e il rilascio di Ca2 + hanno effetti opposti sul clustering di acido gamma – aminobutirrico (GABA) recettoriA (GABAAR) alle sinapsi GABAergica, che è responsabile dell’inibizione della eccitabilità di un neurone3. Afflusso di CA2 + accompagnato da massiccia eccitazione neuronale induce la dispersione di sinaptica GABAAR cluster, mentre persistente Ca2 + rilasciare dall’ER promuove il clustering di sinaptica GABAARs. Altri gruppi hanno anche riferito che la direzione ottimizzazione dei coni di crescita è dipenda criticamente sulla fonte del Ca2 + segnale: afflusso di Ca2 + induce repulsione, mentre il rilascio di Ca2 + guide l’attrazione della crescita neuronale cono4. Di conseguenza, per comprendere appieno il Ca2 + sottostante uscite cellulari specifiche vie di segnalazione, è importante identificare la fonte di Ca2 + segnali descrivendo il Ca2 + segnali alla risoluzione subcellulare.
In questo protocollo, descriviamo un Ca2 + metodo di imaging per segnalare Ca2 + segnali alla risoluzione subcellulare, che consente la stima del Ca2 + di sorgenti di segnale (Figura 1). CA2 + microdomini appena sotto la membrana plasmatica con successo sono monitorati da codificato geneticamente Ca2 + indicatori (GECIs) mirati alla membrana del plasma tramite il collegamento del segnale della membrana plasmatica-localizzazione Lck all’interno di Src chinasi a N-termini di GECIs5. Per rilevare il modello Ca2 + segnale nelle vicinanze di ER con una migliore risoluzione spaziale e temporale, abbiamo recentemente sviluppato OER-GCaMP6f, in cui GCaMP6f6 obiettivi ER membrana esterna, utilizzando la proteina transmembrana ER. OER-GCaMP6f sensibile può segnalare il rilascio di Ca2 + dall’ER una migliore risoluzione spatiotemporal rispetto convenzionale GCaMP6f immaturi di cellule COS-77 e di cellule HEK2938, evitando la diffusione di Ca2 + e GECIs . Inoltre abbiamo confermato che la spontanea Ca2 + elevazione in astrociti ippocampali coltivati segnalato da OER-GCaMP6f ha mostrato un modello spatiotemporal diverso rispetto a quella monitorata da GCaMP6f membrana plasmatica targeting (Lck-GCaMP6f)7 ,9, che indicano che il Ca2 + imaging con OER-GCaMP6f in combinazione con Lck-GCaMP6f contribuisce alla dissezione di Ca2 + segnali alla risoluzione subcellulare per identificare le loro fonti.
Attualmente, abbiamo dettaglio il protocollo per la dissezione Ca2 + segnale in cellule HeLa e neuroni-astrociti placcati su vetrini coprioggetti colture miscelati. Il Ca2 + tecnica di imaging con GECIs indicato qui, Lck-GCaMP6f, plasma-membrana-mirati RCaMP210 (Lck-RCaMP2), e OER-GCaMP6f (Figura 1) sono applicabili a tutte le celle in cui questi GECIs può essere espresso.
Diverse uscite biologici vengono avviate da Ca2 + segnali. CA2 + è un versatile Messaggero di segnalazione intracellulare. Decodifica di Ca2 + segnali per evocare uscite specifiche è stata una questione biologica fondamentale, e Ca2 + tecniche di imaging per descrivere la diversità di Ca2 + segnali sono necessari. Il protocollo attualmente dettagliato consente la rilevazione di Ca2 + segnali distinti alla membrana plasmatica ed ER (Figura 3 e Figura 4) e Ca2 + microdomini locali all’interno di una cella (Figura 4 e Figura 5). Ciò contribuisce a descrivere la diversità di Ca2 + segnali intracellulari. La risoluzione temporale di Ca2 + segnali inoltre è stata migliorata di mira GECIs nella membrana plasmatica ed ER perché può evitare l’effetto di una diffusione tridimensionale di Ca2 + e GECIs se stessi, e ha il potenziale per rilevare la momento di afflusso di Ca2 + o Ca2 + release, che si verifica sulla membrana.
Il protocollo presenta alcune limitazioni. Gli utenti dovrebbero tenere a mente che i segnali rilevati sono la sommatoria del “momento di afflusso di Ca2 + o rilascio” e “Ca2 + diffusa fuori dall’origine Ca2 +” , soprattutto per grandi Ca2 + segnali. Ad esempio, anche se la sua stimolazione in cellule HeLa evoca Ca2 + rilascio dall’ER, sua risultante Ca2 + segnali vengono rilevati non solo di OER-GCaMP6f ER-mirati, ma anche di plasma-membrana-mirati Lck-RCaMP2 (Figura 3). Un’altra limitazione è che il modello spatiotemporal di Ca2 + segnali potrebbe non essere l’unico fattore dell’uscita di Ca2 + segnali. La distribuzione delle proteine effettrici a valle (ad esempio Ca2 +-dipendente chinasi e fosfatasi) può anche essere una determinazione fattore2. Per decodificare completamente i Ca2 + segnali intracellulari, analisi del comportamento degli enzimi a valle, che non rientra in questo protocollo, sono assolutamente necessario.
Uno degli aspetti più critici per il successo Ca2 + formazione immagine è l’imaging acquisizione immagine e installazione condizioni, anche per quanto riguarda altri studi di formazione immagine live. Precedentemente abbiamo indicato che Ca2 + risposte nella cella sono altamente dipendenti sulla durata e l’intensità dell’eccitazione e su condizioni di acquisizione immagine, tra cui l’esposizione tempo e acquisizione frequenza16. Potenza di illuminazione di eccitazione è il fattore più critico, in quanto può causare tossicità luce e photobleaching di GECIs. Le condizioni di registrazione del tempo di esposizione, frequenza, intensità della luce di eccitazione e la durata di registrazione di registrazione dovrebbero essere ottimizzate in base allo scopo dell’esperimento. Si consiglia di ridurre il tempo di esposizione e l’intensità della luce di eccitazione per quanto possibile di evitare photobleaching e fototossicità alla cella. La frequenza di registrazione e la durata di registrazione dovrebbe essere sufficiente a coprire i Ca2 + elevazione eventi di interesse ma dovrebbe essere tenuti più bassi possibile evitare anche photobleaching e fototossicità. Si consiglia di determinare la frequenza di registrazione e la durata prima e ottimizzando l’intensità della luce e il tempo di esposizione, in modo che il photobleaching del GECIs è ridotto al minimo. Un altro fattore importante è il livello di espressione della GECIs. GECIs hanno un Ca2 +-buffering effetto come sono Ca2 +-proteine leganti. Di conseguenza, la sovraespressione di GECIs provoca il buffering di Ca2 +, che è fisiologicamente necessari per le cellule. La quantità di espressione GECI dovrebbe essere minimizzata per evitare imaging cellule che esprimono quantità elevate di GECIs.
In conclusione, la dissezione di Ca2 + segnali ad una risoluzione subcellulare è uno dei passi più importanti per la decodifica Ca2 + segnali intracellulari che determinano il fenomeno biologico di uscita. Questo protocollo fornisce un nuovo metodo per la dissezione di Ca2 + segnali per descrivere la diversità tra questi segnali. Attualmente, questa tecnica è limitata per gli esperimenti in vitro. Tuttavia, Lck-GCaMP6f è già utilizzato per in vivo Ca2 + imaging in topi17e OER-GCaMP6f è stata confermata per monitorare Ca2 + segnali in vivo nei neuroni di motore VD in c. elegans7. Di conseguenza, GECIs nel compartimento subcellulare di targeting ha il potenziale per essere ampliato in vivo imaging in futuro, quindi permettente Ca2 + dissezione in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è supportato dalle seguenti sovvenzioni: il Giappone Science and Technology Agency (JST) / Precursory ricerca per embrionale di scienza e tecnologia (PRESTO) (JPMJPR15F8, Giappone); la società giapponese per la promozione della scienza (JSPS) / sovvenzioni in aiuti per la ricerca scientifica (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), Takeda Foundation. Gli autori ringraziano Haruhiko Bito (Università di Tokyo) per la fornitura di RCaMP2 e Arthur J.Y. Huang e Thomas McHugh (RIKEN CBS) per la fornitura di vettori AAV e per le istruzioni per quanto riguarda la preparazione di AAV. Gli autori vorrei anche ringraziare gli editor presso la Gazzetta di esperimenti visualizzati per il loro aiuto con riprese video e montaggio.
(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) | Tocris | #0342 | |
0.5% DNase I stock solution | Sigma-Aldrich | #11284932001 | Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30°C. |
0.5% Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | #25300054 | |
100 mM L-glutamine (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #25030081 | Preparing small aliquots of 250–750 µL and store at -30°C. |
100 mM Sodium pyruvate (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #11360070 | Aliquots (10 mL) can be stored at -20°C. After thawing, the solution can be maintained at 4°C for 2 months. |
12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid | Falcon | #353043 | Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used. |
18-mm diameter circular coverslips | Karl Hecht "Assistent" | #41001118 | Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used. |
1M HEPES | Thermo Fisher Scientific | #15630080 | pH 7.2 – 7.6 |
2.5% Trypsin stock solution (×20 stock) | Sigma-Aldrich | #T4674 | Prepare 150 µL aliquot and store at -30°C. |
50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution | Sigma-Aldrich | #P3143 | Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30°C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating. |
70% Ethanol | Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection. | ||
Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter | AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request. | ||
B-27 supplement (×50 stock) | Thermo Fisher Scientific | #17504044 | This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566). |
B57BL/6 | Japan SLC, Inc. | ||
Camera for microscopic image recording | The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) or CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0) | ||
Cell freezing container | Sarstedt K.K. | #95.64.253 | Alternative cell freezing container can be used. |
Cell strainer | Falcon | #352350 | |
CO2 incubator | Maintain at 37°C, 5% CO2. | ||
Cryogenic tube | Corning | #430661 | Alternative cryogenic tubes can be used. |
Cryopreservation medium | Zenoaq | "CELLBANKER1" | |
Culture medium (for HeLa cells) | Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 µg/mL) | ||
Dissection medium | One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM | ||
DMEM | Nacalai | #08456-65 | Alternative DMEM can be used. |
DMEM | Nacalai | #08456-65 | Low glucose |
DNA transfection reagent | Sigma-Aldrich | #6366244001 | "X-tremegene HP DNA transfection reagent" Alternative transfection reagents can be used. |
Glass jar with a lid | 500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal | ||
HBSS | Thermo Fisher Scientific | #14170161 | HBSS free of calcium and magnesium |
Heat inactivated bovine serum | Thermo Fisher Scientific | #10100147 | |
HeLa cells | RIKEN BioResource Center | #RCB0007 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | #H7125 | |
Image analysis software | Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made) | ||
Image splitting optics | Hamamatsu Photonics | #A12801-01 | W-view GEMINI |
Image splitting optics dichroic mirror | Semrock | #FF560-FDi01-25×36 | For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein (GFP/RFP) signal |
Image splitting optics emission filters | Semrock | #FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25 | For emission of GFP/RFP signal, respectively |
Imaging medium and buffer | Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator. | ||
Incubation saline | Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS | ||
Inverted fluorescence microscope | Such as IX73 (Olympus) or Eclipse TI (Nikon Instech) | ||
Isoflurane | Pfizer | Used for anesthesia | |
Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes) | 48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes) | 12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
MEM (Minimum Essential Medium) | Thermo Fisher Scientific | #11090-081 | |
Microscope filter set for GCaMP6f imaging | Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm) | ||
Microscope filter set for RCaMP2 imaging | Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass) | ||
Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f | Semrock | #FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25 | Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging. |
Microscope heating system | A heating system to maintain cells at 37°C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended. | ||
Microscope light source for excitation | Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity. | ||
Microscope objective lens | Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes. | ||
Neurobasal plus medium | Thermo Fisher Scientific | #A3582901 | |
Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher Scientific | #10888022 | Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium. |
PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+ | Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation | #164-23551 | The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used. |
PC and image acquisition software | Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14. | ||
Penicillin-Streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | #15140122 | Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL |
Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9 | Available upon request | ||
Plating medium (for 4 × 12 well dishes) | 48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival. | ||
Recording chamber | Elveflow | Ludin Chamber | This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips. |
Reduced serum media | Thermo Fisher | #11058021 | Opti-MEM |
Stereomicroscope | Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available. | ||
Surgical instruments | Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains, 3 forceps with fine tips (Dumont Inox #5) | ||
Transfection reagent for neuron | Thermo Fisher Scientific | #L3000008 | "Lipofectamine 3000" reagent. It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4. |
Trypan blue (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | #15250061 | |
Wash medium for frozen cortical cells | 25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin. | ||
Wistar rats | Japan SLC, Inc | Pregnant rats (E18) |